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《大连工业大学》 2014年
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产丁醇大肠杆菌的基因工程改造初步研究

王庆龙  
【摘要】:随着能源与环境问题的日益加深,丁醇因其优越的理化性质成为了汽油的潜在替代品,微生物产丁醇受到广泛关注。大肠杆菌遗传背景丰富且基因操作简洁,在丁醇生产中有巨大的潜力。本文在研究中选择五个关键基因:phaA,hbd,crt,ter,adhE1,构建了由厌氧启动子 Phya 介导的四个质粒 pCNA-PT、pRNA-hbd、pENA-crt、pCDA-adhE1,共同转入大肠杆菌Bw25113中进行丁醇发酵未能得到丁醇。进一步对该四质粒丁醇合成系统进行改造,用强启动子Pxya替换Phya得到质粒pCNX-pt、pCDX-adhE1、pENX-crt与原质粒pRNA-hbd共同转入Bw25113进行丁醇发酵,得到丁醇产量为0.483g/L。同时将phaA-hbd-crt和ter-adhE1基因簇分别导入载体质粒构建了由Phya介导的pCNA-PHC、pENA-TA双质粒丁醇表达系统。菌株Bw25113转入双质粒丁醇表达系统后得到丁醇产量为0.51g/L。通过四质粒表达系统与双质粒表达系统的比较,可以确定丁醇的生成与关键基因的有序表达相关,并且受启动子效率的影响很大。为了能够稳定表达丁醇合成通路,构建了质粒pCNA-PHCF和pENA-TAF。以Red/ET系统为基础,发展出一种新的具有商业价值的基因重组技术用于产丁醇大肠杆菌的快速构建。对野生大肠杆菌敲除adhE和ldhA基因,同时整合外源基因簇phaA-hbd-crt、ter-adhE1到基因组。最终得到产丁醇重组大肠杆菌BuS2。通过菌株BuS2的简单发酵实验发现:TB培养基是大肠杆菌丁醇发酵较好的培养基;葡萄糖是丁醇发酵的较好碳源,浓度在2.5%时消耗速度最快;最佳厌氧起始OD600值为5.0。从对发酵产物的分析得知,丁醇途径的表达提高了乙酸的产量,并且伴随丁酸、甲酸、丙酮和乙醇等副产物的生成。通过单基因对比发酵,鉴定phaA基因导致乙醇的重新合成。以文中最佳条件进行发酵,在32h得到丁醇的最高产量1.877g/L。本文创建的快速构建产丁醇大肠杆菌的方法,不仅可以用于产丁醇大肠杆菌的后续研究,而且因其相比传统方法较好的遗传稳定性与非诱导的表达性能,对其他生物工程菌株的研究具有应用价值,相信可以得到广泛应用。
【学位授予单位】:大连工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q78

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