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《黑龙江中医药大学》 2015年
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温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠胰岛素受体后信号通路作用机制研究

姜广坤  
【摘要】:目的:本研究采用单纯长程20周高脂肪饲料喂养正常SD雄性大鼠,模拟接近人类IGT的发病过程,建立单纯饮食诱导型的IGT动物模型,从胰岛素受体后信号通路探讨IGT发病的机制,进一步探讨温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠作用机制及其作用靶点,为临床合理治疗IGT提供实验依据,并为大鼠IGT模型复制的研究,提供技术平台。方法:将符合IGT模型标准的大鼠随机分为温胆汤组、加味温胆汤组以及IGT模型对照组三组,另设普通饲料喂养的空白对照组。空白对照组、IGT模型对照组每天按固定时间以1 Oml/kg体积灌胃给予蒸馏水,温胆汤组(6.1 8g/kg)、加味温胆汤组(11.25g/kg)灌胃给予同体积的相应复方水煎剂。HE染色法观察肝脏、骨骼肌、脂肪组织形态变化,免疫组化法测定大鼠肝脏、骨骼肌、脂肪组织中的PI3K、PKB、GSK-3β、GLUT-4蛋白的表达,Western Blot法测定大鼠肝脏、骨骼肌中PKKB、GSK-3β、GLUT-4、ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白及总蛋白的表达,RT-PCR法测定大鼠肝脏、骨骼肌中GLUT-4、ERK1/2、p38 MAPK mRNA的表达,从而探讨IGT的发病机制及温胆汤、加味温胆汤的作用靶点。结果:(1)肝脏组织:空白对照组肝细胞形态清晰,细胞质、细胞核染色均匀,肝板排列规整;IGT模型组大鼠出现细胞核固缩,细胞质染色不均匀,呈现脂肪变性,散在少量炎性细胞;与模型组比较,给药组肝细胞形态比较规整,有的肝窦清晰可见,存在少量细胞核固缩。骨骼肌组织::空白对照组大鼠骨骼肌的肌束排列整齐,细胞核位于肌束边缘,成扁平状,无炎性细胞存在;IGT模型组大鼠骨骼肌染色不均匀,肌纤维排列不规整,部分细胞嗜酸性增强,细胞核固缩;给药组肌纤维排列比较规整,细胞核固缩较少,肌纤维紧密。脂肪组织:空白对照组脂肪细胞大小比较均匀,形态清晰规整,染色均匀;IGT模型组脂肪细胞染色不均匀,形态不规则,细胞核固缩,毛细血管明显增多,有散在红细胞存在;与IGT模型组比较,给药组脂肪细胞染色较均匀,形态相对清晰规整,细胞核固缩较少,毛细血管明显减少,少数红细胞存在。(2)与空白对照组比较,IGT模型组大鼠骨骼肌中PI3K、PKB、GLUT-4蛋白表达显著降低(P0.01或P0.05),GSK-3β蛋白表达显著升高(P0.01或P0.05),温胆汤、加味温胆汤均可以显著升高大鼠骨骼肌中PI3K、PKB、GLUT-4蛋白表达(P0.01或P0.05),降低GSK-3β蛋白表达(P0.01或P0.05);与空白对照组比较,IGT模型组大鼠肝脏组织中PI3K、GLUT-4蛋白表达显著降低(P0.01或P0.05),PKB、GSK-3β蛋白表达显著升高(P0.01或P0.05),温胆汤、加味温胆汤均可以显著升高大鼠肝脏中PI3K、GLUT-4蛋白表达(P0.01或P0.05),降低PKB蛋白表达,对GSK-3β蛋白表达无调节作用。(3)与空白对照组比较,IGT模型组大鼠骨骼肌中ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达显著降低(P0.01或P0.05),温胆汤、加味温胆汤均可以显著升高ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达(P0.01或P0.05);与空白对照组比较,IGT模型组大鼠肝脏中ERK1/2蛋白表达无显著性差异,p38 MAPK蛋白表达显著升高(P0.01);温胆汤可以显著降低ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达(P0.01),而加味温胆汤却可显著升高ERK1/2、p38MAPK蛋白表达(P0.01)。(4)与空白对照组比较,IGT模型组大鼠骨骼肌中ERK1/2、p38MAPK、GLUT-4 mRNA表达显著升高(P0.01),而温胆汤、加味温胆汤均可以显著降低IGT大鼠骨骼肌中ERK1/2、p38 MAPK、GLUT-4 mRNA表达;与空白对照组比较,IGT模型组大鼠肝脏中ERK1/2、p38 MAPK、GLUT-4 mRNA表达显著降低(P0.01),而温胆汤、加味温胆汤均可以显著升高IGT大鼠肝脏中ERK1/2、GLUT-4 mRNA表达(P0.01或P0.05),加味温胆汤还可以显著升高 p38 MAPK mRNA 表达(P0.05)。结论:长期高脂饮食可以建立符合人类标准的IGT大鼠动物模型,其胰岛素受体后信号通路传导出现障碍,PI3K、MAPK通路一些关键蛋白、基因出现异常表达,而温胆汤、加味温胆汤均可以显著调节其异常表达,但两方的作用靶点和对蛋白的调节作用也存在着差异。
【关键词】:IGT模型 PI3K通路 MAPK通路 温胆汤
【学位授予单位】:黑龙江中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R285.5
【目录】:
  • 缩略语表5-7
  • 中文摘要7-9
  • Abstract9-12
  • 前言12-13
  • 文献综述13-32
  • 一、糖耐量低减(IGT)现代医学研究13-17
  • 1. IGT的诊断标准13
  • 2. IGT流行病学13-14
  • 3. IGT病因与病机14-16
  • 3.1 胰岛素抵抗14
  • 3.2 脂联素14-15
  • 3.3 炎症反应15
  • 3.4 视黄醇结合蛋白415
  • 3.5 血脂血压15-16
  • 4. IGT的干预治疗16-17
  • 4.1 二甲双胍16
  • 4.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂16-17
  • 4.3 噻唑烷二酮类(TD)17
  • 二、IGT的中医研究进展17-22
  • 1. IGT中医病因病机17-20
  • 1.1 中医病因17-18
  • 1.2 中医病机18-20
  • 2. IGT中医干预治疗20-22
  • 三、温胆汤与加味温胆汤22-26
  • 1. 温胆汤渊源22
  • 2. 温胆汤方证22-23
  • 3. 温胆汤现代研究23-26
  • 3.1 对精神神经系统的影响24
  • 3.2 对心脑血管系统的影响24-25
  • 3.3 对呼吸系统的影响25
  • 3.4 对消化系统的影响25
  • 3.5 其他25-26
  • 4. 加味温胆汤26
  • 四、胰岛素受体后信号通路26-32
  • 1. 葡萄糖转运因子-4(glucose transporter type 4,GLUT-4)27
  • 2. 酪氨酸激酶(PI3K)通路27-29
  • 2.1 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)28
  • 2.2 蛋白激酶B(PKB或称Akt)28-29
  • 2.3 糖原合成酶激酶-3(GSK-3)29
  • 3. 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路29-32
  • 3.1 ERK途径29-30
  • 3.2 p38 MAPK途径30-31
  • 3.3 JNK途径31-32
  • 实验研究32-63
  • 1. 实验材料32-35
  • 1.1 实验动物32
  • 1.2 高脂饲料32-33
  • 1.3 实验试剂33-34
  • 1.4 主要仪器34-35
  • 2. 实验方法35-42
  • 2.1 IGT大鼠模型复制35
  • 2.2 分组及给药35-36
  • 2.3 大鼠肝脏、肌肉、脂肪形态学观察36
  • 2.4 大鼠骨骼肌、肝脏、脂肪组织中PI3K、PKB、GSK-3β、GLUT-4蛋白相对含量测定36-37
  • 2.5 大鼠骨骼肌、肝脏、脂肪组织中PKB、GSK-3β、GLUT-4、p38 MAPK、ERK1/2 MAPK蛋白含量测定37-39
  • 2.6 大鼠骨骼肌、肝脏、脂肪组织中ERK1/2、p38、GLUT-4 mRNA表达39-42
  • 2.7 数据处理42
  • 3. 测定结果42-63
  • 3.1 大鼠肝脏、肌肉、脂肪HE染色观察42-44
  • 3.2 对大鼠骨骼肌、肝脏、脂肪组织中PI3K、PKB、GSK-3β、GLUT-4蛋白相对含量的影响44-51
  • 3.3 对大鼠骨骼肌、肝脏组织中PKB、GSK-3β、GLUT-4、p38 MAPK、ERK1/2 MAPK蛋白表达的影响51-57
  • 3.4 对大鼠骨骼肌、肝脏组织中mRNA表达的影响57-61
  • 3.5 对大鼠骨骼肌、肝脏组织中ERKI/2、p38、GLUT-4 mRNA表达的影响61-63
  • 讨论63-75
  • 1. 中医干预IGT,预防DM发生的优势63-64
  • 2. IGT模型复制的可行性探讨64-65
  • 3. 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠胰岛素信号PI3K通路的影响65-70
  • 3.1 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠PI3K蛋白表达的影响66
  • 3.2 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠Akt/PKB蛋白表达的影响66-68
  • 3.3 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠GSK-3β蛋白表达的影响68-69
  • 3.4 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠GLUT-4蛋白表达的影响69-70
  • 4. 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠胰岛素信号MAPK通路的影响70-73
  • 4.1 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠ERK1/2蛋白及基因表达的影响70-72
  • 4.2 温胆汤、加味温胆汤对IGT大鼠p38MAPK蛋白及基因表达的影响72-73
  • 5 温胆汤与加味温胆汤对IGT大鼠胰岛素信号通路作用机制的比较73-75
  • 结论75-76
  • 参考文献76-89
  • 致谢89-90
  • 攻读博士学位期间发表的论文90-92
  • 简历92-93

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