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《哈尔滨师范大学》 2018年
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大豆GmCBL2基因的克隆及功能鉴定

高慧纯  
【摘要】:植物在生长发育过程中会受到很多非生物胁迫的威胁,例如高pH、氧化、干旱、热、盐等胁迫,都严重影响着植物的生长发育。Ca~(2+)是植物中普遍存在的第二信使,广泛参与植物的生长状态、衰老速度的调控,在响应生物胁迫和非生物胁迫等方面也起着重要的作用。钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)是一组钙离子感受器,能够与一类蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK)互作来解码特异Ca~(2+)信号,从而对逆境胁迫作出响应。CBL家族在许多物种中都有研究,但目前对大豆CBL家族的研究较少。本文以“黑农52”为实验材料,应用qRT-PCR技术分析了高pH、高镁、氧化胁迫条件下大豆GmCBL2基因的表达模式,并分析了该基因的生物信息学特征;通过同源克隆技术,从大豆中克隆了与拟南芥AtCBL2基因同源的GmCBL2基因,并构建了GmCBL2基因的植物过表达载体,将该基因成功转化到烟草中。对转基因植株进行抗逆性分析,确定了该基因与非生物胁迫耐受性的关系。获得的主要研究成果如下:1.GmCBL2基因在逆境胁迫下的表达模式分析对大豆幼苗分别进行高pH(100mmol/L NaHCO_3)、高镁(20mmol/L MgCl_2)、氧化(10mmol/L H_2O_2)胁迫处理,通过qRT-PCR分析GmCBL2基因在0、1、5、12、24h的表达模式,结果表明,GmCBL2基因对三种胁迫均有不同程度的应答,但被氧化胁迫诱导最显著。2.GmCBL2基因的克隆与序列分析根据拟南芥AtCBL2基因序列在大豆数据库(www.Phytozome.com/soybean)进行同源比对获得大豆同源序列GmCBL2,通过RT-PCR克隆获得GmCBL2基因CDS序列,该序列全长681bp,编码226个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,GmCBL2蛋白与木豆中的同源蛋白的亲缘关系最近。3.GmCBL2基因对烟草的遗传转化构建了pBWA(V)HS-GmCBL2植物过表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得了转GmCBL2基因的PCR阳性植株。RT-PCR结果证明GmCBL2已在转录水平表达。4.转基因烟草的抗逆性鉴定对转基因植株进行了100mmol/L NaHCO_3、10mmol/L H_2O_2、20mmol/L MgCl_2胁迫下的表型分析,结果发现,转基因植株和野生型植株离体叶片在高pH、高镁胁迫下叶片均黄化,但在氧化胁迫下转基因植株叶片仍然保持鲜绿,而野生型叶片黄化明显。对转基因植株进行了10mmol/L H_2O_2胁迫下的氧化胁迫相关生理指标(POD、CAT、SOD、MDA)分析,结果表明,转基因植株清除活性氧自由基的能力总体高于野生型植株,表明GmCBL2能够通过提高抗氧化酶活性来增强植株对氧化胁迫的抗性。
【学位授予单位】:哈尔滨师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2

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