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《上海海洋大学》 2018年
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尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究

蔡玉臻  
【摘要】:罗非鱼是我国重要的养殖品种之一,在我国南方广泛养殖。2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病,链球菌病的主要病原有海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施,主要依赖抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。疫苗具有安全、高效、无残留等优点,可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。目前已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道,但其具有一定的局限性,使之不能进行大面积的推广。研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。本研究构建了重组表达无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)的乳酸菌穿梭表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,通过灌胃口服的方式对其免疫原性进行了研究。研究内容和结果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因穿梭表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表达质粒pNZ8124-Sip和非分泌型穿梭表达质粒pNZ8148-sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸乳球菌。采用SDS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测。研究结果显示:构建的分泌型重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48KDa的特异性蛋白,非分泌型的表达蛋白为45KDa,与目的蛋白大小一致;SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以胞内可溶性蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。本研究成功构建了尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白非分泌型乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-sip和分泌型菌株NZ9000-pNZ8124-sip,并诱导表达出大量的胞内可溶性Sip蛋白,为尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗的制备提供了条件,为下一步的免疫原性检测奠定了基础。2尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性研究为了探究尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性,本研究将重组菌在最佳诱导条件下获得NZ9000-pNZ8124-sip、NZ9000-pNZ8148-sip重组菌分别以不同浓度(2.24×10~9 CFU/mL(低浓度组)、2.24×10~(10) CFU/mL(中浓度组)和2.24×10~111 CFU/mL(高浓度组))灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,对照组分别灌胃口服等剂量的2.24×10~(10) CFU/mL的NZ9000-pNZ8124、NZ9000-pNZ8148和NZ9000菌株以及PBS溶液。隔周免疫1次,共免疫2次。第1次免疫后第1、2、4、8、16和21d采集各组罗非鱼血清样本,通过试剂盒方法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、碱性磷酸酶(AKP)活力及溶菌酶(SOD)活性变化情况;采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化;采集免疫后各组罗非鱼的胸腺、肝、脾和肠组织,通过荧光定量PCR方法检测其免疫相关基因IgT、IgM、CD8a、C3的相对表达量;首次免疫后第21d采用无乳链球菌腹腔注射人工感染各组罗非鱼,获得其相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)。结果表明,分泌型和非分泌型重组乳酸菌活载体疫苗口服免疫后,中浓度组第一次免疫后IgT、IgM、CD8a、C3基因在胸腺、肝、脾脏、肠组织中的相对表达量均上调表达,随着时间的推移呈现下调趋势,第二次免疫后再次出现上调表达;攻毒前(第一次免疫后第21d)分泌型和非分泌型活载体疫苗中浓度组罗非鱼血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)活力和碱性磷酸酶(AKP)活力均显著高于PBS组。罗非鱼的血清抗体水平分泌型和非分泌型乳酸菌疫苗的NZ9000组、空载体组、NZ9000-8148-sip低浓度组和NZ9000-8124-sip高浓度组与PBS组无显著性差异;中浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~9 CFU/mL)与PBS组有显著性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,分别在16d和4d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。无乳链球菌人工感感染实验结果表明,口服免疫2次能够显著提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。罗非鱼的血清抗体水平非分泌型表达载体组的中浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和高浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(11) CFU/mL)与PBS组有显著性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,均在第21d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。免疫2次能够显著提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为61.6%。从整体的免疫效果分析非分泌型活载体疫苗的效果要优于分泌型。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S948

【参考文献】
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1 赵海军;杨彬彬;郝跃;陈荣溢;黎锐恒;岑坚;陈飞;霍琪;刘建芳;;我国罗非鱼出口现状及对策[J];食品安全质量检测学报;2015年12期
2 王瑞;李莉萍;黄婷;梁万文;雷爱莹;黄维义;李健;梁聪;甘西;陈明;;罗非鱼链球菌病弱毒活疫苗和灭活疫苗口服接种抗原示踪及保护率比较[J];西南农业学报;2015年01期
3 王蓓;黎源;陈贺;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;蔡佳;吴灶和;简纪常;;我国华南地区罗非鱼源无乳链球菌分子流行病学研究[J];水产科学;2014年12期
4 全琛宇;杨磊;王凯;王瑞;李丽萍;梁万文;甘西;李健;陈明;;口服无乳链球菌弱毒疫苗对罗非鱼肠道影响的组织学观察[J];动物医学进展;2014年10期
5 曾祖聪;曹建萌;卢迈新;可小丽;刘志刚;高风英;朱华平;;罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达[J];南方水产科学;2014年05期
6 包特力根白乙;;中国罗非鱼养殖产业发展及市场前景[J];中国水产;2014年09期
7 张意敏;刘志刚;卢迈新;朱华平;可小丽;高风英;黄樟翰;;复方中草药对尼罗罗非鱼非特异性免疫功能的影响[J];淡水渔业;2015年01期
8 王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常;;吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达[J];生物技术通报;2014年07期
9 陈雪;可小丽;卢迈新;刘志刚;高风英;朱华平;曹建萌;;罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的原核表达及免疫原性分析[J];水产学报;2014年05期
10 王蓓;简纪常;蔡双虎;黄郁葱;汤菊芬;吴灶和;;罗非鱼无乳链球菌DNA疫苗的构建及免疫效果研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2013年12期
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1 李春涛;黄颡鱼IgM分子及其表达研究[D];西南大学;2012年
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1 李桂欢;罗非鱼源无乳链球菌嵌合型亚单位疫苗与DNA疫苗的研制及免疫效果评价[D];广东海洋大学;2014年
2 彭民毅;广西罗非鱼无乳链球菌病病原分离、鉴定及毒力基因检测分析[D];广西大学;2014年
3 叶飞;乳酸乳球菌usp45基因的功能研究及其在表达载体构建中的应用[D];吉林农业大学;2014年
4 刘亮;罗非鱼无乳链球菌病DNA疫苗的研究及有效中草药的筛选[D];中山大学;2013年
5 邓恒为;海南罗非鱼链球菌病病原分离鉴定及防治中草药筛选[D];海南大学;2013年
6 唐瞻杨;广西罗非鱼产业化发展现状的研究[D];广西大学;2012年
7 黎炯;罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及重组表面免疫原性蛋白His-Sip的免疫效果初步研究[D];上海海洋大学;2011年
8 吕翠;鲤鱼新型免疫球蛋白IgT的粘膜免疫功能研究[D];山东师范大学;2011年
9 陆炳招;杂交罗非鱼(Oreochromis niloticus × O.aureus)对动物蛋白源的利用研究[D];广东海洋大学;2010年
【共引文献】
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1 王博;李加儿;冯娟;马红玲;申亚阳;郭志勋;;番石榴叶水提物对拟穴青蟹抗病毒病能力及部分血清免疫因子的影响[J];南方农业学报;2015年12期
2 张德锋;刘礼辉;任燕;李宁求;林强;潘厚军;石存斌;吴淑勤;;我国罗非鱼源新型无乳链球菌的分离、鉴定及其分子特征[J];中国水产科学;2015年05期
3 彭银辉;蔡小辉;熊向英;刘旭佳;黄国强;;拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件的优化[J];生物技术通报;2015年07期
4 朱佳杰;周宇;敖秋桅;谭芸;甘西;;吉富罗非鱼抗病选育品系的养殖效果评估[J];安徽农业科学;2015年16期
5 王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;吴灶和;简纪常;;无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗的制备及免疫效果评价[J];水产学报;2014年11期
6 曾祖聪;曹建萌;卢迈新;可小丽;刘志刚;高风英;朱华平;;罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达[J];南方水产科学;2014年05期
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1 刘婵;广东省罗非鱼无乳链球菌分子流行病学及耐药性研究[D];天津农学院;2018年
2 郭富强;温度对罗非鱼无乳链球菌致病机制影响的研究[D];上海海洋大学;2018年
3 蔡玉臻;尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究[D];上海海洋大学;2018年
4 王双艳;半滑舌鳎免疫相关基因IgT和pIgR的克隆及表达分析[D];上海海洋大学;2018年
5 王婧怡;猪传染性胃肠炎病毒抗体检测iELISA的建立及S1基因重组乳酸菌载体的构建[D];内蒙古农业大学;2017年
6 韩强音;四种主要饲料植物蛋白原料对彩虹鲷池塘养殖生长性能与品质的影响研究[D];广西大学;2017年
7 孔重敏;枯草芽孢杆菌和甘蔗蜜糖在罗非鱼养殖中运用的研究[D];华南农业大学;2017年
8 袁伟;中国罗非鱼源无乳链球菌流行特征及耐药性研究[D];上海海洋大学;2017年
9 吴梦晓;温度及中草药对无乳链球菌的疗效研究[D];海南大学;2017年
10 付天增;无乳链球菌和海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果[D];山东农业大学;2017年
【二级参考文献】
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1 赵海军;李红权;种炎;王丽霞;周豪迟;欧安;陈文;黄武;霍琪;蒋方军;;我国进口三文鱼质量安全现状及对策研究[J];食品安全质量检测学报;2015年10期
2 赵海军;范万红;霍琪;苏海龙;欧安;黄武;;中美进出口水产品质量安全现状及对策研究[J];广东海洋大学学报;2015年05期
3 赵海军;王伟;吕朋;吴志刚;欧安;黄武;霍琪;李红权;;俄罗斯输华水产品质量安全现状及对策研究[J];检验检疫学刊;2015年04期
4 李晓钟;黄蓉;袁永明;;中国对美国罗非鱼出口增长效应分析[J];国际经济合作;2015年01期
5 程波;李乐;康铜;黄磊;宋怿;;中国罗非鱼质量安全现状调查分析[J];中国渔业质量与标准;2014年06期
6 包特力根白乙;;中国罗非鱼养殖产业发展及市场前景[J];安徽农业科学;2014年33期
7 付少徉;;美国食品安全贸易壁垒对中国罗非鱼出口的影响及其对策[J];食品研究与开发;2014年18期
8 王玉梅;曹俊明;储霞玲;万忠;李思发;;2013年广东罗非鱼产业发展形势与对策建议[J];广东农业科学;2014年08期
9 代云云;袁永明;张红燕;贺艳辉;;中国罗非鱼出口贸易的SWOT分析与对策[J];江苏农业科学;2014年04期
10 陈雪;可小丽;卢迈新;刘志刚;高风英;朱华平;曹建萌;;罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的原核表达及免疫原性分析[J];水产学报;2014年05期
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1 徐镇;中华鳖免疫球蛋白连接链和重链基因与抗体产生规律[D];华中农业大学;2009年
2 彭博;鲫鱼免疫球蛋白基因的鉴定、应答和功能研究[D];浙江大学;2008年
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1 赵晶晶;中草药对点带石斑鱼生理生化指标和抗病力的影响[D];天津农学院;2012年
2 张雪利;红笛鲷重组激活基因克隆及表达分析[D];广东海洋大学;2012年
3 陈贺;罗非鱼源无乳链球菌灭活疫苗的研制及其免疫效果的研究[D];广东海洋大学;2012年
4 陈荣荣;广州地区罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及致病生物学研究[D];南京农业大学;2012年
5 谭晶晶;奥尼罗非鱼无乳链球菌的鉴定及免疫预防的初步研究[D];华中农业大学;2011年
6 李小勇;海洋鱼类细菌性病原微生物GAPDH蛋白的定位和功能初步研究[D];华东理工大学;2011年
7 陈虹;中草药对8种畜禽肠道病原菌的体外抑菌试验[D];甘肃农业大学;2009年
8 褚明亮;奶牛乳房炎链球菌的分离鉴定及抗原基因的克隆和表达[D];石河子大学;2008年
9 王向柳;奶牛乳腺炎三联苗田间试验及牛源无乳链球菌CAMP因子的克隆表达[D];新疆农业大学;2008年
10 徐增辉;罗非鱼海豚链球菌疫苗的研制及免疫效果的初步研究[D];广西大学;2008年
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1 刘守珠;;西宁地区3468例孕妇生殖道无乳链球菌筛查及耐药性分析[J];青海医药杂志;2018年12期
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6 王兆飞;郭长明;陆承平;刘永杰;;鱼源无乳链球菌透明质酸酶的表达及抗原性分析[J];畜牧与兽医;2014年01期
7 刘晶;吉彤珍;赵娟;;孕妇感染B群无乳链球菌的耐药性分析[J];中国卫生检验杂志;2013年16期
8 金慧心,王艳,张丹莹;关于无乳链球菌感染的新进展[J];黑龙江医学;1998年12期
9 邢杰,王金良;无乳链球菌三种简易鉴定试验[J];临床检验杂志;1996年02期
10 杨仕标;;抗无乳链球菌单克隆抗体[J];云南畜牧兽医;1987年02期
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1 郭淑丽;罗先道;杨丽玮;王婧;王昌敏;;89例无乳链球菌药敏结果分析[A];第九届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文集[C];2018年
2 孙;郭东春;崔玉东;曲连东;;无乳链球菌诊断技术研究进展[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
3 胡长敏;徐海洋;郭爱珍;;新型嵌合亚单位疫苗对小鼠无乳链球菌或金黄色葡萄球菌乳腺炎保护力研究[A];中国畜牧兽医学会——第三届中国兽医临床大会论文集[C];2012年
4 崔静雯;汪开毓;贺扬;陈德芳;王均;张丽杰;;尼罗罗非鱼无乳链球菌脑膜炎模型的建立[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会2016年学术研讨会论文集[C];2016年
5 朱佳杰;敖秋桅;谭芸;吕敏;罗永巨;甘西;;吉富罗非鱼感染无乳链球菌后脾脏转录组学分析[A];2017年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2017年
6 布日额;;牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白抗原性研究[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年
7 鲁炳怀;;无乳链球菌临床定植与感染研究进展[A];第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2016年
8 华春珍;俞蕙;庄捷秋;李小露;许红梅;卢洪萍;罗巧二;俞惠民;曹云;陈益平;张婷;王传清;景春梅;张泓;陈学军;林振浪;张婧;杜立中;;2011-2015年7家三甲医院181例儿童无乳链球菌血流感染分析[A];第十三届江浙沪儿科学术会议暨2016年浙江省医学会儿科学学术年会论文汇编[C];2016年
9 穆飞飞;孙龚;刘乐锋;李闰婷;邓洪宇;佟春玉;姜海芳;陈亮;呼锐;朱战波;崔玉东;;无乳链球菌Sip蛋白的表达及免疫保护作用研究[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
10 王娟;卞国志;王贵平;袁建丰;;无乳链球菌恒温热隔绝式PCR快速检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集[C];2017年
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1 中国农业大学动物医学院 冯军科 赵德明;奶牛场无乳链球菌的综合防控[N];河北科技报;2017年
2 中山大学附属东华医院 张丽华;无乳链球菌所致新生儿败血症[N];医药经济报;2009年
3 记者 徐宁通讯员 杨一民;教授下乡下田农民省心省钱[N];三峡日报;2008年
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1 汪明;分子生物技术检测病原菌及其临床应用研究[D];武汉大学;2012年
2 樊杰;奶牛乳房炎病原菌耐药性及无乳链球菌抗原基因研究[D];甘肃农业大学;2014年
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5 黄锦炉;罗非鱼无乳链球菌病病原学、病理学及cpsE基因的原核表达研究[D];四川农业大学;2012年
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1 侯国锋;CRISPR在E.coli基因编辑与GBS消除中的研究[D];海南大学;2018年
2 蔡玉臻;尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究[D];上海海洋大学;2018年
3 张雨薇;不同动物源无乳链球菌荚膜多糖血清型及分子分型研究[D];四川农业大学;2017年
4 王凯;抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体的制备及初步应用[D];广西大学;2014年
5 刘家玲;3794例妊娠期妇女生殖道无乳链球菌的筛查及分子流行病学研究[D];遵义医学院;2018年
6 郭富强;温度对罗非鱼无乳链球菌致病机制影响的研究[D];上海海洋大学;2018年
7 丁浩;罗非鱼无乳链球菌病防治药物的筛选[D];上海海洋大学;2018年
8 郭勇;无乳链球菌血清型及耐药分子机制研究[D];苏州大学;2017年
9 徐晶晶;嵌合裂解酶的重组表达及其抗菌作用研究[D];武汉大学;2018年
10 张亚坤;无乳链球菌重组GapC蛋白与脂蛋白(a)的相互作用[D];内蒙古农业大学;2018年
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