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《南京大学》 2015年
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沉默信息调节因子1在实验性脑出血后继发性脑损伤中的作用研究

王春喜  
【摘要】:脑出血发生率占所有卒中的10-15%,具有很高的致死致残率。目前,临床上尚无治疗脑出血的有效措施。血液破人脑实质内导致原发性损伤及继发性损伤。原发性损伤主要是由于血肿扩大以及血肿占位效应导致,而继发性损伤有种平行机制导致,包括血液成分的损伤、氧化应激和炎症等,他们互相影响、互相作用导致脑损伤,最终导致残疾甚至死亡。而目前越来越多证据证实炎症在脑出血后继发性脑损伤中起着关键作用。核因子-kappaB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)在调控炎症反应中起着关键作用。在细胞无刺激时,NF-κB主要与NF-κB抑制因子(inhibitor of NF-κB,IκB)结合而位于细胞浆中。在细胞受到多种刺激时,诱导IκB激酶(IκB kinase,IKK)磷酸化IκB,导致其降解,进而促使NF-κB核转移及激活NF-κB靶基因表达。NF-κB已被证实在脑出血后被激活,并且参与脑出血后炎症反应及脑损伤。目前,有证据表明可逆的RelA/p65亚单位乙酰化也可以调控NF-κB信号,而这一过程依赖于特定位点赖氨酸残基的乙酰化。特别的,p65的310号位点赖氨酸残基的乙酰化是p65完整转录及NF-κB激活所必须的。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)作为一种高度保守的依赖于NAD+的脱乙酰化酶,在多种多样细胞过程中起作用。SIRT1可通过使p65第310号位点赖氨酸残基脱乙酰化而负向调控炎症反应。而且SIRT1在多种脑损伤起着保护作用。然而,SIRT1在脑出血后的脑损伤中的作用尚不清楚。我们推测SIRT1可能在脑出血中起着保护作用,并且通过使p65脱乙酰化而抑制炎症反应。第一部分目的:我们的目的是检测SIRT1在脑出血后血肿周围组织中的表达变化及脑细胞定位。方法与结果:雄性ICH小鼠被随机分为sham组以及脑出血后8h、1天、2天、3天、5天以及7天组。使用基底节区注射IV胶原酶诱导出血模型。通过Western blot、免疫组化及免疫荧光检测SIRT1的表达。同时还检测了乙酰化p65(lys310)。结果发现SIRT1在脑出血后表达下降,而乙酰化p65的表达升高。相关性分析发现SIRT1的表达于乙酰化p65的表达成负相关。而免疫荧光双染提示SIRT1主要表达于神经元而不是小胶质细胞和星形胶质细胞。除此之外,我们使用血红蛋白刺激原代神经元造成脑出血体外模型发现,SIRT1随着血红蛋白的刺激时间增加而表达降低。结论:SIRT1在脑出血后神经元内表达下降。SIRT1可能参与了脑出血后的脑损伤及炎症反应过程。第二部分:目的:SIRT1在脑出血后的确切作用尚不明确。因此在第二部分,我们使用白藜芦醇(SIRT1强效激动剂)以及EX527(SIRT1特异性抑制剂)来研究SIRT1在脑出血后脑损伤及炎症反应中的作用。方法与结果:使用胶原酶诱导的小鼠脑出血模型。小鼠在诱导出血30min后使用溶剂或白藜芦醇治疗。在脑出血后1到3天进行神经功能评分,出血后72h进行脑水含量检测。Western blot及免疫荧光检测脑出血72h后乙酰化p65的表达。同时ELISA检测炎症因子IL-1β及TNF-α。使用TUNEL染色检测神经细胞凋亡。此外,使用EX527来确定SIRT1的作用。白藜芦醇(60mg/Kg)可缓解神经功能缺损、减轻脑水肿及减少神经细胞凋亡,同时可降低神经元内的乙酰化p65表达以及其下游促炎因子((IL-1β及TNF-α)产生。而EX527可阻断白藜芦的所有效果。结论:这些结果表明,SIRT1通过使p65脱乙酰化抑制炎症反应,从而保护脑出血后脑损伤。而SIRT1的激动剂白藜芦醇亦可保护脑出血后脑损伤。第三部分:目的:漆黄素是一种黄酮类化合物具有多种生物学效应,包括神经保护作用及抗炎作用。有证据表明漆黄素具有与白藜芦醇类似可激活SIRT1及延长在低等生物生命的效果。然而,漆黄素是否可经过调控SITR1/NF-κB而保护脑出血后脑损伤尚不知。因此,在本部分,我们主要研究漆黄素对脑出血后脑损伤及SITR1/NF-κB的影响。方法与结果:使用胶原酶诱导的小鼠脑出血模型。漆黄素(25mg/kg或者50mg/kg)于造模后1小时经腹腔给药。结果显示漆黄素可缓解神经功能损伤及减少脑水肿。并且漆黄素可诱导SIRT1表达上调,同时下调乙酰化p65(lys310)及促炎症因子(IL-1β及TNF-α)。而EX527可拮抗漆黄素通过上调SITR1而抑制NF-κB乙酰化的作用。结论:因此,本研究证实漆黄素可通过上调SITR1而抑制NF-κB乙酰化缓解脑出血后脑损伤。总结:我们的研究显示SIRT1在脑出血后神经元内表达下降。使用白藜芦醇或者漆黄素激活SIRT1可通过使p65第310位氨基酸残基脱乙酰化抑制NF-κB依赖的炎症反应保护脑出血后脑损伤。因此SIRT1可能成为脑出血后治疗的潜在靶点。而白藜芦醇和漆黄素具有治疗脑出血的价值。
【关键词】:脑出血 继发性脑损伤 沉默信息调节因子1 核因子-kappaB 炎症 白藜芦醇 漆黄素
【学位授予单位】:南京大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R743.34
【目录】:
  • 缩略词表6-9
  • 前言9-10
  • 中文摘要10-13
  • 英文摘要13-17
  • 第一部分: 绪论17-50
  • 第一节: 脑出血后脑损伤机制18-28
  • 第二节: SIRT1在神经系统损伤中的保护作用28-36
  • 参考文献36-50
  • 第二部分: 实验性脑出后沉默信息调节因子1(SIRT1)在脑组织的表达及细胞定位研究50-72
  • 背景51-52
  • 实验材料与方法52-55
  • 实验方法55-59
  • 结果59-66
  • 讨论66-68
  • 结论68-69
  • 参考文献69-72
  • 第三部分: 通过使用白藜芦醇激活SIRT1保护脑出血后脑损伤及机制研究72-99
  • 研究背景73-74
  • 实验材料与方法74-77
  • 实验方法77-82
  • 实验结果82-90
  • 讨论90-93
  • 结论93-94
  • 参考文献94-99
  • 第四部分:漆黄素通过调控SIRT1/NF-κB通路保护脑出血后脑损伤99-117
  • 研究背景100-101
  • 实验材料与方法101-103
  • 实验方法103-106
  • 实验结果106-110
  • 讨论110-112
  • 结论112-113
  • 参考文献113-117
  • 全文总结117-118
  • 博士期间文章情况118-120
  • 攻读博士期间获得的荣誉及奖励120-121
  • 致谢121-123

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