收藏本站
《江南大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

发酵乳杆菌中D-乳酸脱氢酶的克隆鉴定及其应用研究

陈丽霞  
【摘要】:苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是广泛存在于蜂蜜和酸奶、酸面团、泡菜、干酪等发酵食品中的一种天然小分子有机酸。因其安全性高、稳定性佳、抑菌谱宽,溶解性好而被认为是一种新型的天然生物防腐剂。PLA在食品、医药、化妆品等方面都具有广阔的应用前景。本论文对Lactobacillus fermentum中的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)进行克隆表达及其酶学性质的研究,并构建D-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)的共表达菌株,实现辅酶再生,同时,对其全细胞合成D-PLA的条件进行了初步探究。主要研究结果如下:(1)从实验室保藏的20株乳酸菌中筛选得到一株D-苯乳酸产量较强的乳酸菌Lactobacillus fermentum JN248。(2)通过全基因组分析预测,成功克隆4个来自于Lactobacillus fermentum JN248的D-乳酸脱氢酶基因,它们分别为:lf-d-ldh0171(972 bp),lf-d-ldh0031(993 bp),lf-d-ldh0653(999 bp)和lf-d-ldh0940(1179 bp)。构建成功的重组大肠杆菌经诱导表达、酶活力检测,发现4个D-LDHs都具有活性,蛋白分子量分别约为:34.48 kDa,35.99 kDa,36.74kDa,43.08 kDa。通过酶活力验证及比较获得1个重组蛋白(LF-D-LDH0653),其苯丙酮酸还原能力最强。(3)对LF-D-LDH0653的诱导条件进行了优化,得到:当菌体浓度OD_(600)达到0.4时,添加IPTG使其终浓度达到0.3 mmol·L~(-1)为最佳诱导条件。利用镍柱和脱盐柱对LF-D-LDH0653进行纯化,并对酶学性质进行研究:其最适温度为50℃,最适pH为8.0。在较高温度及弱碱性条件下仍能保持较高活性。对丙酮酸、苯丙酮酸的催化作用最强。以苯丙酮酸为底物K_m,k_(cat)和k_(cat)/K_m分别为1.68 mmol·L~(-1),122.66 s~(-1)和73.01 L·mmol~(-1)·s~(-1)。(4)成功克隆来自Bacillus subtilis ATCC 13952中的gdh基因(786 bp),对应蛋白分子量28.16 kDa。并构建E.coli BL21(DE3)/pColdⅡ-ldh-gdh双酶共表达大肠杆菌,实现了辅酶再生。进一步优化了全细胞合成D-PLA的条件:20 mmol·L~(-1)磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 8.0),84 mmol·L~(-1)的葡萄糖,1.5 g·L~(-1)全细胞催化剂,60 mmol·L~(-1) PPA,45℃,200 r·min~(-1)反应3 h,转化率为94.7%。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS201.3

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王新洪;新太;;妊高症孕妇乳酸及乳酸脱氢酶含量的变化[J];中国社区医师(医学专业);2012年27期
2 张春芳;;急性白血病患者乳酸脱氢酶水平的变化研究[J];亚太传统医药;2011年07期
3 黄艳燕;黄靖华;卢福芝;孙靓;彭立新;周兴;黄日波;;鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J];生物技术通报;2010年12期
4 张学舜;何学谦;王毅宾;肖开进;张瑞琼;李付明;;牦牛睾丸乳酸脱氢酶(LDH)及乳酸脱氢酶—X(LDH—X)的初步探讨[J];中国牦牛;1988年02期
5 杨雨善,陈志,胡惠民,柯卫,瞿逢伊;两种伊蚊酯酶和乳酸脱氢酶酶谱的比较研究[J];第二军医大学学报;1988年01期
6 王又明;乳酸脱氢酶C_4对生育力的免疫抑制[J];生物化学与生物物理进展;1988年05期
7 杨燕,张抗;乳酸脱氢酶速率测定法的探讨[J];临床检验杂志;1988年03期
8 李震,王浩,王柏林;外源性雌、雄激素对大鼠睾丸组织中乳酸脱氢酶X的影响[J];生殖与避孕;1988年01期
9 胡连平;吴德昌;龚诒芬;;三种破碎细胞方法的比较研究[J];军事医学科学院院刊;1988年02期
10 大桑哲雄;官村美波留;张坚;何聪;;400和3000米跑后运动员血清乳酸脱氢酶和乳酸脱氢酶同工酶的活性[J];体育科研;1988年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郑玉才;洪键;贺庆华;邝良德;杜晞;金素钰;;牦牛睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因的克隆及其选择性剪接的研究[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年
2 洪键;贺庆华;郑玉才;邝良德;杜晞;金素钰;;睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因选择性剪接的研究[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
3 龚志贇;卢仁泉;左桂兰;高翔;郭林;;日立7600检测系统检测乳酸脱氢酶性能参数的评价[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年
4 胡卫江;李海龙;顾兰兰;夏勇;蒋哲;孟凡国;;肌酸激酶和乳酸脱氢酶标准物质的研制[A];第十届全国酶学学术讨论会论文集[C];2011年
5 管卫;齐静;沈永明;宋爱华;;1例儿童血清乳酸脱氢酶同工酶异常区带的分析[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年
6 徐钰;朱继红;;19例血栓性血小板减少性紫癜临床分析[A];中华医学会急诊医学分会第十六次全国急诊医学学术年会论文集[C];2013年
7 吉雁鸿;郭俊生;李敏;秦海宏;刘民航;赵法伋;;晕船对血清钙、磷、镁、铁、铜、锌及尿素氮、肌酐、乳酸脱氢酶、肌酸激酶的影响[A];中国营养学会特殊营养第五届学术会议论文摘要汇编[C];2002年
8 朱凌峰;于波;;菊糖芽孢乳杆菌CASD中能利用NADPH的D-乳酸脱氢酶744是双功能酶[A];第九届中国酶工程学术研讨会论文摘要集[C];2013年
9 马美刚;吴原;刘秀颖;苏婕;吴月娟;唐玉兰;余璐;;海马神经元癫痫细胞模型的建立及乳酸脱氢酶变化的研究[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
10 张宇金;何立巍;季宇彬;;甜菜碱对S_(180)荷瘤小鼠血清肿瘤标志物乳酸脱氢酶、醛缩酶和肌酸激酶的活力的影响[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 记者 陈青 通讯员 孙国根;乙酰“武装”蛋白质可抑制肿瘤[N];文汇报;2013年
2 孙国根;肿瘤发生、恶化的“微环境”可被清除[N];中国医药报;2013年
3 记者 孙国根;乙酰“武装”蛋白质可抑制肿瘤[N];健康报;2013年
4 记者 王璟;人过五十岁必须保护肺[N];医药养生保健报;2010年
5 记者 王春 通讯员 孙国根;科学家找到“秘密武器”用于清除癌细胞“帮凶”[N];科技日报;2013年
6 栾雪梅;减轻溶血 提高生活质量[N];医药经济报;2004年
中国博士188bet全文数据库 前10条
1 王宏强;线粒体拓扑异构酶1缺失通过增加乳酸脱氢酶A的表达和糖酵解促进胃癌侵袭和转移[D];南方医科大学;2018年
2 董家斌;金黄色葡萄球菌一氧化氮自由基诱导乳酸脱氢酶晶体结构解析和酶活性研究[D];天津医科大学;2009年
3 安保光;水稻D-乳酸脱氢酶基因的克隆和功能分析[D];武汉大学;2014年
4 陈良远;乳酸脱氢酶C4 L153X突变型亚基与野生型亚基的相互作用:一种新的显性负性机制[D];福建医科大学;2017年
5 翟小明;草氨酸钠抑制乳酸脱氢酶对鼻咽癌生长及放射敏感性的影响[D];苏州大学;2014年
6 邱志远;大颗粒淋巴细胞白血病发病机制探讨和克隆性检测[D];南京医科大学;2014年
7 陈炅然;蕨麻多糖的免疫增强作用及自由基药理学研究[D];甘肃农业大学;2008年
8 饶洁;终末期癌症患者治疗的现状调查和相关原因探索[D];华中科技大学;2015年
9 王宗文;unibet怎么样[D];第二军医大学;2015年
10 李兴峰;乳杆菌生物合成苯乳酸的研究[D];江南大学;2008年
中国硕士188bet全文数据库 前10条
1 陈丽霞;发酵乳杆菌中D-乳酸脱氢酶的克隆鉴定及其应用研究[D];江南大学;2018年
2 李雪晴;干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶的表达、定向改造及应用研究[D];江南大学;2018年
3 倪雪;地理环境对乳酸脱氢酶和尿β-2微球蛋白参考值的影响[D];陕西师范大学;2018年
4 韩智涛;骨肉瘤中缺氧诱导HIF-1α调控乳酸脱氢酶-A的机制研究[D];广西中医药大学;2016年
5 方玲;鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究[D];西南大学;2015年
6 张黎;牛链球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[D];广西大学;2005年
7 曹金钰;一株嗜热乳酸菌的鉴定及L-乳酸脱氢酶基因的克隆表达[D];吉林大学;2009年
8 黄彦;乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[D];广西大学;2005年
9 袁剑;干酪乳杆菌中乳酸脱氢酶的克隆表达及其性质的研究[D];江南大学;2012年
10 何海兵;邻苯二甲酸二丁酯孕期暴露仔鼠阴茎组织乳酸脱氢酶B差异表达的研究[D];南京医科大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026