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《南京农业大学》 2016年
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啶虫脒降解菌株的分离、降解关键酶基因克隆及啶虫脒污染土壤生物修复研究

杨洪杏  
【摘要】:啶虫脒是一种高效、低毒、广谱的氯代烟碱类杀虫剂,属于新烟碱类杀虫剂。目前,新烟碱类杀虫剂已成为世界第一大杀虫剂,而啶虫脒又是其中重要种类,被广泛用于防治水稻、蔬菜、棉花、果树和茶叶上的蚜虫、蓟马、飞虱以及部分鳞翅目害虫等。由于啶虫脒的广泛使用,并且其水溶性高,极易通过土壤进入地表水和地下水。此外,啶虫脒对蜜蜂等的急性毒性以及在茶叶、棉花上的残留均有报道。微生物参与的代谢是啶虫脒在环境中消除的主要途径。近年来,已有一些关于啶虫脒微生物降解的报道,但其研究内容多集中于降解菌株的分离和代谢途径的研究,对于啶虫脒降解基因研究较少,仅有一个腈水合酶的报道。此外,啶虫脒污染环境生物修复过程中的分子生态学效应未见报道。因此,分离筛选啶虫脒降解微生物菌株资源、阐明啶虫脒的微生物代谢途径、克隆降解关键酶基因以及揭示啶虫脒生物修复中的分子生态学效应,具有重要的理论意义和潜在应用价值。在本论文的研究中,通过连续富集培养的方法,从生产啶虫脒农药厂的活性污泥中分离筛选到一株能够以啶虫脒为唯一碳源生长的高效降解菌株Pigmentiphagasp.D-2,该菌株可在72 h内降解99%以上的50 mg.L-1啶虫脒,其最适生长和降解温度为37℃,最适生长和降解pH值为7。通过HPLC-MS和MS-MS方法研究了菌株D-2对啶虫脒的代谢途径,发现其存在两个不同的起始步骤:啶虫脒C-N键断裂生成1-(6-氯吡啶基-3-甲基)-N-甲基甲胺(命名为IM1-4)和啶虫脒直接脱氯、脱甲基生成N'-氰基-N-甲基-N-(3-吡啶基甲基)甲脒,后者为首次报道。降解啶虫脒的关键酶蛋白(Acetamiprid amidase,Ama)通过硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose FF离子柱层析和Superdex-200凝胶层析3步纯化流程获得。肽指纹图谱鉴定结合菌株基因组框架图测序结果分析,确定编码蛋白的ORF为orf05630,位于Scaffold26上。ORF分析显示Ama由α和β两个亚基组成,将编码α亚基的基因命名为ama1,基因全长372bp,编码123 aa,分子量为13.5 kDa;编码β亚基的基因命名为ama2,基因全长2295 bp,编码764 aa,分子量为84.2 kDa。通过氨基酸序列比对发现,Ama 的 α 和β亚基与Paracoccus aminophilus的N,N-dimethylformamidase 的α和β亚基具有最高的相似性(分别为35%和56%)。设计引物扩增编码Ama两个亚基的序列,构建表达载体pET-29a-ama,转化入E.coli BL21(DE3)中异源表达,纯化的重组酶Ama能够将啶虫脒水解成IM1-4;Ama的最适酶反应温度为37-55℃;最适酶反应pH值为7.5。加入0.1 mM的Al3+、Fe3+、Fe2+和Li+,对Ama的酶活力有一定的促进作用(提高了 8.2%~20.8%左右);0.1 mM的Cu2+能够抑制61.4%的Ama酶活力;0.1 mM的Hg2+能够抑制96.8%的Ama酶活力。在研究菌株D-2对不同土壤中不同浓度啶虫脒的降解时,发现当啶虫脒浓度较低(50mg·kg-1干土)时,酸性土壤(pH5.45)中啶虫脒在40d内的自然降解率为30.2%,中性土壤(pH 6.75)和碱性土壤(pH 7.85)在15 d内的自然降解率分别为39.6%和59.1%。当啶虫脒浓度较高(200mg·kg-1干土)时,酸性土壤中啶虫脒在40d内自然降解24.3%,中性土壤在15 d内自然降解26.7%,碱性土壤在15 d内自然降解48.1%。推测土壤中的土著微生物在啶虫脒的降解过程中发挥作用,且碱性环境有利于啶虫脒的自然降解。接种菌株D-2能够促进啶虫脒的降解。当啶虫脒浓度为50mg·kg-1干土时,接种菌株D-2可以使酸性土壤中啶虫脒在40d的降解率达94.8%,中性土壤中的啶虫脒在15d的降解率为97.5%,碱性土壤中啶虫脒在15d的的降解率为91.2%。当啶虫脒浓度为200 mg·kg-1干土时,接种菌株D-2时,可以使酸性土壤中啶虫脒40 d的降解率达92.5%,中性土壤和碱性土壤中啶虫脒的15d降解率分别为96.1%和89.6%。通过对不同土壤中降解的研究发现,在酸性土壤中有利于菌株D-2降解能力的发挥。利用MiSeq高通量测序技术研究菌株D-2对不同土壤中不同浓度啶虫脒进行生物修复的生态学效应。三种土壤的Alpha多样性分析结果表明,在酸性土壤和中性土壤中施加啶虫脒会减少土壤中微生物群落的丰富度和多样性。而接种菌株D-2可以增加土壤中微生物群落的丰富度和多样性,菌株D-2能够降解啶虫脒去除毒害胁迫效应,丰富土壤中的微生物群落组成。在碱性土壤中,啶虫脒和菌株D-2并不显著影响土壤中微生物群落的丰富度。三种土壤的Beta多样性分析结果表明,施加啶虫脒仅影响碱性土壤的微生物群落结构,而接种菌株D-2则会改变酸性土壤和碱性土壤中的微生物的群落结构。在啶虫脒浓度为200 mg.kg-1干土并接种菌株D-2的情况下,对酸性和中性土壤细菌门水平的分析表明,在酸性土壤中,变形菌门的相对丰度显著增加(35.4%);在中性土壤中,放线菌门的相对丰度有所增加(4.6%)。而对于碱性土壤中,只施加高浓度的啶虫脒会增加变形菌门的相对丰度(11.4%)。根据已报道的啶虫脒降解菌株所在的菌属信息,在土壤细菌门水平上进行分析,发现三种土壤在施加啶虫脒的情况下,假黄单胞菌属的相对丰度会有一定的增加(增长了 0.03%~0.31%);在同时接种菌株D-2的情况下,假黄单胞菌属(增长了 0.02%~0.37%)、假单胞菌属(增长了 0.17%~0.97%)和寡养单胞菌属(增长了 0~0.58%)都会有增加。在施加菌株D-2时,噬染料杆菌属Pigmentiphaga(所占比例为1.25%~24.37%)都是优势菌属,说明菌株D-2在啶虫脒的降解过程中起到关键作用。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:X592;X172

【参考文献】
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1 张玲玲;耿宝荣;;啶虫脒对中华蟾蜍蝌蚪的急性毒性和微核核异常的诱导作用[J];福建师范大学学报(自然科学版);2015年06期
2 贾雪晴;;新烟碱类杀虫剂在作物保护中的应用述评[J];宁夏农林科技;2015年05期
3 杨琼;王淑会;张文慧;杨田堂;刘永杰;;常用杀虫剂对异色瓢虫的毒力及其保护酶的影响[J];植物保护学报;2015年02期
4 樊龙飞;李明;李荣玉;郁艳;卢春;;水稻和土壤中噻虫胺、啶虫脒残留量高效液相色谱分析[J];江苏农业科学;2015年01期
5 张洪玉;吴清阳;张芝平;毕强;董建生;施顺发;叶振君;;环氧虫啶的合成新工艺[J];世界农药;2014年06期
6 夏围围;贾仲君;;高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价[J];微生物学报;2014年12期
7 蔺哲广;孟飞;郑火青;周婷;胡福良;;新烟碱类杀虫剂对蜜蜂健康的影响[J];昆虫学报;2014年05期
8 邱成;;浅议土壤污染及其防治[J];四川农业科技;2014年01期
9 杨光;;欧盟新烟碱类农药限制令出台回顾[J];农药市场信息;2013年30期
10 于福强;黄耀师;苏州;武恩明;王徵;于春睿;;新颖杀虫剂氟啶虫胺腈[J];农药;2013年10期
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1 李健;杀虫剂啶虫脒的高效降解微生物筛选及代谢研究[D];上海交通大学;2011年
【共引文献】
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1 王瑞琪;廉传江;易诚;韩凌霞;杨春文;陈洪岩;;miR-200b-3p和miR-200b-5p在马立克氏病抗性与易感SPF鸡法氏囊组织的差异表达分析[J];实验动物与比较医学;2017年03期
2 毛伟华;吴三玲;张旭;;土壤微生物16S rDNA的Ion Torrent PGM高通量检测方法构建与应用[J];浙江农业学报;2015年12期
3 田文德;宿程远;冉治霖;覃菁菁;黄智;陈孟林;;新型E-D反应器处理餐厨垃圾效能及微生态研究[J];哈尔滨商业大学学报(自然科学版);2015年05期
4 李秀珍;钟志敏;田忠贞;;含氟顺式新烟碱化合物的合成及生物活性[J];山东化工;2015年18期
5 张超;赵重博;胥敏;杨诗龙;卢一;黄勤挽;吴纯洁;张大永;江云;;半夏曲炮制历史沿革及现代研究[J];世界科学技术-中医药现代化;2015年09期
6 张冬蕾;刘文俊;孙天松;;宏基因组DNA分析技术在传统发酵乳制品微生物多样性研究中的应用[J];乳业科学与技术;2015年05期
7 杜姗;杨唐;赵英杰;;高通量测序在环境微生物学中的应用[J];科技视界;2015年23期
8 吴迟;姜辉;王长宾;张燕;陈昂;崔馨月;何明远;;四种新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及初级风险评估[J];农药学学报;2015年04期
9 杨勇;顾中怡;徐春春;强音;;高效液相色谱法测定氟啶虫胺腈制剂中有效成分含量[J];农药;2015年07期
10 朱先志;刘勇;田雷;刘莉;宗浩;高强;徐蕊;李兰芬;张伟娜;;烟田常用杀虫剂对烟蚜茧蜂的毒力及其保护酶的影响[J];中国烟草科学;2015年03期
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1 郑琛;啶虫脒和杀螟硫磷在烟田中的残留消解及其吸附[D];湖南农业大学;2015年
2 吴曼;啶虫脒在茶叶和土壤中的残留检测及降解动态研究[D];湖南师范大学;2014年
【二级参考文献】
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1 梁巧丽;陆永跃;梁广文;;应用3种方法评价4种新氯化烟碱类杀虫剂对棉花粉蚧的毒力[J];华南农业大学学报;2014年04期
2 符史杭;李玉凤;曹露露;项楠;朱富妹;李侨;;农药啶虫脒对虎纹蛙蝌蚪的急性毒性研究[J];北京农业;2014年15期
3 李贤贤;马晓丹;薛明;赵海鹏;李朝霞;;噻虫胺等药剂对韭菜迟眼蕈蚊的致毒效应[J];植物保护学报;2014年02期
4 吴艳艳;周婷;Abebe Jenberie WUBIE;王强;代平礼;贾慧茹;;吡虫啉对成年意大利蜜蜂脑神经细胞致凋亡作用[J];昆虫学报;2014年02期
5 周婷;宋怀磊;王强;代平礼;吴艳艳;孙继虎;;吡虫啉对意大利蜜蜂脑乙酰胆碱受体分布的影响[J];昆虫学报;2013年11期
6 宋长青;吴金水;陆雅海;沈其荣;贺纪正;黄巧云;贾仲君;冷疏影;朱永官;;中国土壤微生物学研究10年回顾[J];地球科学进展;2013年10期
7 段丽芳;李贤宾;柯昌杰;张宏军;季颖;;欧盟新烟碱类农药限用政策对我国农药相关产业的风险分析[J];农药科学与管理;2013年09期
8 代平礼;周婷;王强;吴艳艳;耿文龙;宋怀磊;;吡虫啉对意大利蜜蜂学习行为的影响[J];农药;2013年07期
9 王丹丹;赵尔宓;;阿维菌素对黑斑侧褶蛙毒理效应的研究[J];四川动物;2013年03期
10 王季鸽;刘育红;;高效液相色谱分析噻虫胺原药[J];河北化工;2013年04期
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1 安亚杰;;快讯[J];营销界(农资与市场);2015年24期
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3 王玉东;;吡虫啉啶虫脒价格速涨[J];农药市场信息;2014年03期
4 杨光;;啶虫脒价格较高,冬储少[J];农药市场信息;2012年03期
5 雷筱娱;;啶虫脒国内专利发展动态[J];农药研究与应用;2011年03期
6 申洪利;韩玉臻;鲁民芳;王永新;宋福泉;朱学勇;;3%啶虫脒防治棉蚜田间药效试验研究[J];北京农业;2009年21期
7 冯明祥;3%啶虫脒防治黄蚜效果好[J];山西果树;2004年02期
8 张强,薛超彬,罗万春;5%啶虫脒·高氯乳油防治桃蚜的效果[J];农药;2001年01期
9 杨永梅;陈琦;;茶汤中啶虫脒残留及其安全性评估[J];黄山学院学报;2016年05期
10 陆通安;戴宏武;施云弟;顾凌;;急性啶虫脒中毒2例临床分析[J];齐齐哈尔医学院学报;2015年07期
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1 王建国;张夕林;李晓霞;周玉;于正茂;;啶虫脒防治莲藕蚜虫应用技术研究[A];植物保护与粮食安全——第二十届全国植保信息交流暨农药械交流会论文集[C];2004年
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3 吴长兴;赵学平;吴声敢;陈丽萍;苍涛;俞瑞鲜;田光明;;啶虫脒对日本鹌鹑生长与繁殖影响[A];粮食安全与植保科技创新[C];2009年
4 梁庆杰;孟昭香;;5%啶虫脒·高效氯氰菊酯乳油防治烟粉虱试验[A];第二十一届全国农药械“双交会”论文集[C];2005年
5 周玉;张夕林;王陈;王建国;李晓霞;;啶虫脒、氟啶脲等药剂防治小麦穗期害虫的研究[A];植物保护与粮食安全——第二十届全国植保信息交流暨农药械交流会论文集[C];2004年
6 王震;袁立博;左娟;翟雨淋;邓新平;;丁硫克百威与啶虫脒不同配比对桃蚜的室内毒力测定[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
7 李儒海;褚世海;朱文达;;3%啶虫脒乳油对麦长管蚜的生物测定及药效试验[A];第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集[C];2004年
8 白义川;谷希树;陈学新;徐维红;胡学雄;郝永娟;刘佰明;;美洲斑潜蝇寄生蜂对设施蔬菜常用农药的敏感性评价[A];生物入侵与生态安全——“第一届全国生物入侵学术研讨会”论文摘要集[C];2007年
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3 记者 金嘉捷;吡虫啉价格周期性上涨 原药厂家已暂停接单[N];上海证券报;2017年
4 方圆;低温会影响啶虫脒防效[N];江苏农业科技报;2007年
5 本报记者 王玉东;多品种价格稳中有降 啶虫脒可能强势反弹[N];农资导报;2016年
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7 记者 陈其珏;杀虫剂市场活跃 啶虫脒一个月涨逾30%[N];上海证券报;2012年
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7 杨桂玲;农产品中农药多残留联合暴露风险评估方法研究[D];中国农业科学院;2017年
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1 吴曼;啶虫脒在茶叶和土壤中的残留检测及降解动态研究[D];湖南师范大学;2014年
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4 李莉;分子烙印及相关技术用于啶虫脒和磺胺甲噁唑的识别[D];河北大学;2005年
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6 田金玲;木质素基缓/控释农药的制备及其性能研究[D];东北林业大学;2015年
7 邓博;啶虫脒与苦参碱混配剂对烟粉虱毒力测定及田间药效评价[D];西北农林科技大学;2015年
8 魏书娟;两种施药方法下啶虫脒在甘蓝叶片内的残留及其对蚜虫活性的关系[D];山东农业大学;2009年
9 王广驰;烯啶虫胺和啶虫脒对蚯蚓的氧化胁迫及基因毒性[D];山东农业大学;2015年
10 李向阳;啶虫脒与内溴磷在甘蓝及土壤中的残留动态研究[D];山东大学;2012年
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