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《南京农业大学》 2016年
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茶树铝-氟互作及拟南芥氟毒性机制研究

杨瑛  
【摘要】:氟是非常重要的卤族元素,主要以氟化物的形式广泛分布在环境中。高浓度的氟毒害植物细胞,影响植物正常生长。茶园中茶树(Camellia sinensis)可累积大量氟,主要累积在叶片中,但植物正常生长,一般不出现氟毒害症状。茶叶是人体摄入氟的主要来源,摄入过多的氟影响人体健康。氟不是植物生长的必需元素,茶树为何吸收高浓度氟、如何在叶片中累积高浓度氟而不受毒害,是研究植物耐氟机制的重要问题。另一方面,茶树是嗜酸、嗜铝植物。茶园酸性土壤中铝活性较高,一定量的铝刺激茶树生长,茶树叶片富集高浓度铝,而且叶片铝、氟含量往往呈现显著的正相关。水溶液中铝与氟可形成铝氟络合物。因此,茶树累积并耐受高浓度氟是否与茶树嗜铝特性有关,是探究茶园茶树耐氟性的关键问题。目前,关于植物耐氟机制的研究仅停留在生理水平。植物体哪些基因可能参与调控细胞吸收、运输氟,是需要探索和研究的新问题。为回答上述问题,本论文开展以下两方面的研究:(1)模拟茶园土壤低pH、高铝、高氟特点,设置不同铝氟交互处理试验,观察不同处理条件下茶树根系和叶片生长状况,分析铝对茶树吸收、转运氟的影响。通过19F-NMR技术,分析铝对茶树根系、叶片中氟形态的影响。(2)运用正向遗传学方法,通过建立拟南芥EMS诱变库,筛选出耐氟拟南芥突变体,通过图位克隆方法和高通量测序技术,克隆出控制拟南芥耐氟表型的基因。通过qRT-PCR、目的基因启动子融合GUS报告基因表达、35S启动子启动YFP和目的基因融合蛋白表达等方法,研究响应氟胁迫的目的基因功能。获得了如下主要结果:(1)水培条件下,观察不同铝氟交互作用处理后的茶苗,结果发现,铝刺激茶树根系生长,而氟抑制茶树根系生长。氟胁迫后,茶树新叶叶缘坏死,严重时生长点坏死。氟处理条件下,添加铝处理能明显缓解氟对茶树叶片和根系生长的抑制作用。土培试验结果表明,当茶树叶片的铝氟摩尔浓度比大于1时,茶树叶片不出现氟中毒症状,而当该比例小于1时,茶树叶片坏死,严重时,整个植株死亡。因此,茶树是对氟毒害敏感的植物,而铝显著缓解茶树氟毒害。(2)利用氟离子选择性电极,我们测定水培条件下不同铝氟处理茶苗根系和叶片氟浓度。结果表明,铝处理明显提高茶树根系氟浓度,而降低叶片氟浓度。19F-NMR结果表明,只供应氟条件下,营养液中出现化学位移为0ppm的游离氟单一峰。添加铝处理后,游离氟信号消失,在化学位移为-37.2ppm、-36.6ppm和-35.5 ppm处出现信号很强的峰,结合GEOCHEM化学反应模型计算结果,推测这两峰分别代表AlF2+、AlF2+和AlF3。分析茶树根系和叶片细胞汁液中氟形态结果,发现氟处理条件下,茶树根系和叶片细胞汁液中均有信号很强游离氟单一峰。添加铝处理后,该峰信号在根系和叶片汁液中明显减弱,并且在叶片汁液中出现化学位移为AlF2+络合物的峰。上述结果说明,铝通过与氟形成络合物影响茶树氟吸收、转运和细胞毒性,缓解了茶树氟中毒。(3)为了进一步研究植物氟毒害机制,我们建立了拟南芥EMS诱变库,并以野生型拟南芥主根生长被抑制一半时的氟浓度(200μM)为筛选条件,成功筛选出4株拟南芥耐氟突变体(ftol1-4)。F1杂交试验结果表明,这4株突变体为等位基因突变。图位克隆和高通量测序结果表明,耐氟突变体突变基因为LPR2,编码一种多铜氧化酶。氟胁迫条件下,LPR2基因T-DNA插入突变体与本论文筛选出的耐氟突变体ftol1耐氟表型一致。将野生型拟南芥LPR2基因通过农杆菌转基因方法回补至ftol1突变体后,氟胁迫条件下,回补株系与野生型拟南芥表型一致。上述结果表明,LPR2是引起拟南芥根系氟毒害表型的因果基因。(4)采用qRT-PCR和LPR2启动子启动GUS报告基因方法,我们发现,LPR2基因在拟南芥地上部和根系均有表达,且在地上部表达高于根系。GUS染色结果表明,LPR2在叶片、叶柄基部有强烈表达。LPR2在根系表达的地方中柱受挤压,因此,LPR2有可能在侧根原基处表达。采用35S启动子启动YFP和LPR2融合蛋白方法分析LPR2亚细胞定位,结果表明,LPR2在细胞质中表达。LPR2组织定位和亚细胞定位均与其同源基因LPR1编码的蛋白完全不同,因此,LPR2可能有与其同源基因LPR1不同的新功能。(5)已有报道LPR1参与主根生长对低磷条件的响应,并且低磷条件下铁中毒是低磷响应的主要原因。在本文中,我们通过比较不同浓度磷、铁、氟处理培养基条件下不同拟南芥Col-0、lpr1、ftol1和lpr1 lpr2双突变表型差异,发现培养基铁有效性是低磷处理抑制拟南芥主根生长的关键因素,是充足磷条件下LPR2基因突变拟南芥表现耐氟表型的关键因素。低磷条件下,LPR1基因参与铁毒害。充足磷条件下,LPRP基因参与铁毒害。充足磷、高铁条件下,氟加剧铁毒害。在充足磷、高铁和添加氟条件下,野生型拟南芥叶片和根系铁浓度、主根根尖超氧自由基含量与耐氟突变体ftol1无显著差异。采用同步辐射X-射线吸收光谱分析表明,在充足磷、高铁条件下,添加氟处理后增加野生型拟南芥叶片三价铁比例,而对ftol1无明显影响。因此,充足磷、高铁条件下,氟可能通过改变地上部铁价态加剧野生型拟南芥铁毒害。推测LPR2参与Fe2+氧化,添加氟促进此过程,导致野生型拟南芥铁中毒,LPR2突变减缓由氟诱导的铁毒害。综上所述,氟对茶树产生毒害作用,茶园茶树不出现氟中毒症状是因为,茶园酸性土壤条件下铝活性较高,铝通过与氟络合影响茶树对氟的吸收、转运及茶树组织中氟的形态,缓解茶树氟中毒。在拟南芥中,LPR2通过将二价铁氧化为三价铁过程来参与氟诱导的铁毒害,抑制拟南芥主根生长。本论文研究结果加深了对植物氟毒害和耐氟机制的了解。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S571.1;Q943.2

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