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《南京农业大学》 2015年
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大豆花叶病毒P3蛋白的寄主互作因子筛选、鉴定及功能验证

栾鹤翔  
【摘要】:大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)是对大豆生产影响最大的病毒之一,全球范围内的大豆产区不同程度受SMV的影响,影响大豆产量和籽粒外观。SMV是单链正义的RNA,含一个开放阅读框,转录产生一条多肽,经自身蛋白切割成11个成熟的蛋白,其中P3与SMV的毒性和寄主范围密切相关。本研究构建了一套基于泛素裂解的酵母双杂交文库,用P3做诱饵对文库进行筛选,对得到的寄主互作因子进行相关功能分析。本实验室双向电泳结果显示,GmEF1b在抗病品种中上调表达。而延伸因子家族的成员常以复合体的形式存在并发挥作用,EF1b是其中一个亚基,因此一并对GmEF1b做功能分析。用基于菜豆荚斑驳病毒(BeanPodMottleVirus,BPMV)诱导的基因沉默系统,在抗感不同品种中沉默GmEF1 a和GmEF1 b及液泡ATP酶(Vacuolar ATPase,VATPase)三个候选基因,检测其对不同SMV株系侵染的反应。同时检验对马铃薯Y病毒属其它病毒及细菌等不同病原物的抗性反应。通过研究不同候选基因的功能,确认其在SMV侵染、复制及运动中的作用,揭示SMV的复制机理,为培育抗病材料奠定基础。主要研究结果如下:1.酵母双杂交文库的构建为高通量研究互作蛋白,对酵母双杂交捕获载体进行Gateway化改造,经测序验证最终得到含attB的捕获载体pPR3-N-R1R2。以南农1138-2接种SMV强毒株系SC15后的叶片RNA为材料,构建了以pPR3为终端载体的三框型酵母双杂交cDNA文库。对酵母双杂交文库质量鉴定发现,文库库容量为0.68×107;随机挑取32个克隆,PCR显示文库的插入片段在0.8-4.5 kb之间,文库重组率高达94%。库容和插入片段结果显示文库质量较高,适合用于酵母双杂交文库的筛选。2.与P3互作的寄主因子的筛选及互作验证以SC15-P3蛋白为诱饵对cDNA文库进行筛选,随机挑选120个阳性克隆测序,对测序结果进行Blastt比对分析,得到50个互作的蛋白,植物体内的蛋白功能预测共分为9类:转录相关、能量代谢、基本代谢、DNA结合、膜相关蛋白、病害相关、信号转导、未知蛋白等。选取重要的GmEF1a-17g和GmVATPase-1Og与P3共转化互作验证,结果显示在酵母中均与P3存在较强的相互作用。随后的双分子荧光互补(BiFc)发现美国株系G5、G7和中国强毒株系SC15的P3均与GmEF1a和GmVATPase在细胞质和细胞核内存在相互作用,免疫共沉淀也验证了互作关系的存在。3.候选蛋白性质分析对蛋白进行不同组分分离发现GmEF1a、GmEF1b和GmVATPase是可溶性蛋白,P3是膜蛋白。亚细胞定位显示GmEF1a定位在内质网上,少量存在细胞核中,GmEF1b和P3定位在内质网和细胞核中。GmEF1a和P3的共定位显示,P3存在时GmEF1a定位在除了内质网之外的细胞核内,而GmEF1b和P3的共定位结果与单独定位一致。细胞核定位信号试验显示GmEF1a、GmEF1b和P3均含有细胞核定位信号,GmEF1a与P3的相互作用促进在细胞核的表达。亚细胞定位显示GmVATPase在内质网上表达,并且有大量的小泡存在,暗示与其功能相关。4.基于BPMV的病毒诱导的基因沉默材料的构建GmEF1a-的 7g180 bp(L63-G122)、GmEF1b-13g的 225 bp(L134-P208)和GmVATPase-10g的192bp(G9-G72)分别作为沉默插入片段构建到BPMV-RNA2载体上,体外转录并接种大豆叶片,成功获得有表型的沉默材料,qRT-PCR显示,3个基因均在各自的沉默材料内被沉默,其中GmEF1a-17g沉默效率为42%,GmEF1b-13g沉默效率为68%,GmVATPase-10g沉默效率为78%。5.延伸因子家族GmEF1a和GmEF1b功能分析对GmEF1a和GmEF1b沉默材料的检测发现,在Essex背景下,沉默材料接种G5和G7的病毒症状明显减轻,在Rsv1背景下接种G7显示2个沉默材料与对照相比,典型的细胞坏死症状消失,qRT-PCR显示细胞坏死标记基因Hsr203j明显少。Western blot和ELISA结果显示在沉默材料的接种叶和上位叶病毒出现晚并且病毒的积累量明显降低,表明沉默GmEF1a和GmEF1b影响SMV的增殖,但对SMV的长距离运输没有影响。沉默GmEF1a和GmEF1b的植株接种BYMV,Western blot显示BYMV积累量与对照相比没有变化。综上可知,SMV在大豆体内的增殖和运动依赖需要GmEF1a和GmEF1b的参与。Harosoy(Rpg1-b Rpg2)背景下沉默 GmEF1a,分别接种 Pseudomonas syringae pv.Glycinea不同小种Psg.Vir,Psg.avrC和Psg.avrB,与对照相比接种Psg.avrB后细菌数量明显多,而接种Psg.Vir、Psg.avrC后细菌数量没有变化,说明GmEF1a参与Rpg2介导的抗性反应,而对基础抗性和Rpg3介导的抗性没有影响。Harosoy背景下沉默GmEF1b,分别接种Psg.Vir、Psg.avrC和Psg.avrB,与对照相比,细菌数量没有变化,说明GmEF1b不参与Rpg2介导的抗性反应。RT-PCR对GmEF1a同源基因T-DNA插入的3个拟南芥突变体进行检测,结果显示三个突变体敲除了各自的目的基因,而对另外的基因拷贝没有影响。三个突变体分别摩擦接种TCV的体外转录物和CMV病毒粒子,接种叶和上位叶的Western blot显示与野生型相比,病毒表达量没有变化。百草枯处理的三个突变体表型和野生型没有差别。三个突变体接种Pst.DC3000和Pst.rpt2之后的细菌数量与野生型没有差别。内质网应激诱导处理三个突变体,一天后接种TCV和CMV,Western blot显示病毒积累量与野生型没有差别。因此我们推定,突变一个EF1a拷贝,对拟南芥调控TCV和CMV没有影响,对Psg的抗性途径也没有影响。6.内质网应激与病毒复制关系病毒侵染质体通常引起内质网应激和内质网应激反应的相关基因BIP和NRP的表达。qRT-PCR显示健康大豆接种G5,BIP和NRP分别上调8倍和10倍,即SMV侵染大豆引起内质网应激。沉默材料SilEF1a和SilEF1b接种G5后BIP和NRP的表达量没有变化,而对照明显上调表达,沉默GmEF1a和GmEF1b大豆丧失内质网应激反应。以抽真空的方式,用内质网应激诱导剂衣霉素和二硫苏糖醇处理健康大豆Essex,一天后接种SMV和BYMV,Western blot和ELISA显示SMV含量在内质网应激诱导后含量明显上升,而BYMV的含量没有变化,说明内质网应激促进SMV的积累。蔗糖密度梯度离心分离SMV和内质网膜,发现SMV与内质网膜蛋白BIP共分离。以上结果表明SMV复制发生在内质网上,需要GmEF1a和GmEF1b的参与,SMV的聚集引起内质网应激反应,沉默GmEF1a和GmEF1b会降低内质网应激反应,植株表现更抗病。7.Vacuolar VATPase 的功能分析对沉默材料的检测发现,在Essex背景下,沉默材料接种G5和G7的病毒症状明显降低,在Rsv1背景下接种G7显示三个沉默材料与对照相比,细胞坏死明显减少。Western和ELISA结果表明沉默材料的接种叶和系统叶病毒出现晚并且病毒的积累量明显降低;对病毒量的比较发现,与对照相比接种叶片的病毒减少倍数比上位叶大。沉默GmVATPase同样影响SMV的复制和扩散,但对SMV的长距离运输没有影响。沉默GmVATPase的植株SA含量比对照高,外源喷施50 mM SA,两天后接种SMV,SMV积累量比对照降低,即沉默GmVATPase影响SA代谢途径。对SilVATPase和对照接种SMV后进行转录组测序,数据分析发现差异表达基因中上调表达的基因占64%,其中甲基转移酶在SilVATPase中上调表达。Western显示沉默甲基转移酶基因后的植株SMV积累量比对照多,甲基转移酶基因正向调控SMV侵染。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S435.651

【参考文献】
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