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《福建医科大学》 2017年
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TNFAIP8在早孕期滋养细胞上的表达及其沉默后对早孕期滋养细胞增殖和侵袭的影响

林容  
【摘要】:目的本研究对早孕期绒毛外滋养细胞进行体外实验模拟胎盘形成的初始环境,明确TNFAIP8在早孕期绒毛滋养细胞中的表达,通过腺病毒转染技术沉默绒毛滋养细胞中的TNFAIP8基因,并通过流式细胞仪、Transwell、细胞划痕实验等方法探讨沉默该基因后对绒毛滋养细胞凋亡和侵袭、迁移能力的影响,为子痫前期的临床管理提供新的干预靶点。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNF-AIP8)参与了细胞凋亡的调节及控制过程,并在肿瘤细胞增殖、细胞信号转导、侵袭及炎症反应等过程中发挥重要调节作用。在正常早期妊娠中,绒毛外滋养细胞参与子宫螺旋动脉的生理性扩张即螺旋动脉重塑,一旦该细胞侵袭能力受损,可导致螺旋动脉重塑障碍,胎盘缺血缺氧,导致“胎盘浅着床”,子痫前期的发生。在前期研究中,利用人类全基因组DNA甲基化芯片分析子痫前期患者和正常产妇的胎盘组织,发现子痫前期胎盘上TNFAIP8低甲基化,胎盘组织中TNFAIP8主要表达在绒毛外滋养细胞上,二者TNFAIP8的表达有差异性~([1])。因此,TNFAIP8蛋白可能参与调控滋养细胞的数量和侵袭能力,干扰子宫螺旋动脉重塑过程,导致胎盘浅着床,参与子痫前期的发生。方法1.应用免疫组化法验证正常早孕期绒毛细胞中TNF-AIP8为阳性表达。2.留取绒毛组织及外周血,通过Western-blot检测二者TNFAIP8蛋白的表达量的相关性。3.由上海生工构建含siRNA的pTrack-CMV质粒及空质粒(TNFAIP8序列:CCACCTTAATAGACGACACAA,空质粒:TTCTCCGAACGTGTCACGT),并通过转染293细胞获得腺病毒颗粒,将其转染HTR8/SVneo滋养细胞株,通过荧光显微镜观察转染情况,并运用RT-PCR、Western-blot检验转染效果。将细胞分为3组:TNFAIP8沉默组(感染携带有TNFAIP8-siRNA的病毒)、空白对照组(未感染病毒的HTR8/SVneo滋养细胞)和阴性对照组(感染携带有scr-siRNA的病毒),进行Transwell小室实验比较三组细胞的侵袭力以及进行细胞划痕实验观察并拍摄细胞的迁移及增殖情况,采用流式细胞仪研究三组细胞凋亡率。结果1.在正常早孕期绒毛细胞胞浆中TNF-AIP8阳性表达,在绒毛组织及外周血淋巴细胞的TNF-AIP8蛋白表达量呈正相关性。2.将含siRNA、scrRNA的pTrack-CMV病毒颗粒转染HTR8/SVneo滋养细胞,应用RT-PCR和Western-blot检验TNFAIP8基因沉默效果,TNFAIP8沉默组与对照组比较,TNFAIP的蛋白表达和mRNA水平显著降低(P0.05),成功构建TNFAIP8沉默细胞株及空白与阴性对照组。将上述三组细胞进行Transwell小室实验、细胞划痕实验及细胞凋亡率实验。Transwell小室实验结果发现TNFAIP8沉默细胞组穿过小孔细胞数低于空白对照组、阴性对照组,差异有统计学意义(P=0.000)。细胞划痕实验证实TNFAIP8沉默细胞组细胞划痕宽度宽于空白对照组及阴性对照组,三者对比差异有统计学意义(P=0.000)。培养36h后的三组细胞通过FCM法检测凋亡率,发现TNFAIP8沉默细胞组凋亡率高于对照组,三组差异有统计学意义(P0.05)。结论1.TNF-AIP8在正常早期妊娠绒毛细胞胞浆中呈阳性表达。TNF-AIP8的低表达影响绒毛滋养细胞的侵袭及迁移能力,增加细胞的凋亡率。2.正常早期妊娠者外周血血淋巴细胞的TNF-AIP8蛋白与绒毛组织中TNF-AIP8的蛋白含量呈正相关性。3.TNFAIP有望成为子痫前期临床早期诊断预测的临床指标。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R714.244

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