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《武汉大学》 2014年
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嗜麦芽菌素P28的生物学特征及其调控基因的初步鉴定

刘健  
【摘要】:嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一种重要的全球范围的机会致病菌,该菌极端耐药性的特征导致人们对该菌感染的治疗手段非常有限。因此,迫切需要开发新型的抗嗜麦芽寡养单胞菌感染制剂。 嗜麦芽寡养单胞菌P28菌株分离自土壤样品,可以同时合成丝状噬菌体φSHP2和嗜麦芽菌素P28(maltocin P28).我们使用离子交换层析法对以上两种成分进行了分离。噬菌体φSHP2呈长丝状,大小为800×10nm,主要衣壳蛋白分子量约为3kDa。双链DNA合成实验证明嗜麦芽寡养单胞菌P28中的质粒pSHP2是φSHP2的复制型。噬菌体φSHP2基因组大小为5817nt,推测由9个ORF组成,其中orf1-orf7以同一方向进行转录,两个反向转录的基因为orf8和orf9。序列分析表明ORF1蛋白质可能是一个复制起始因子(Rep);orf2编码单链DNA结合蛋白(SSB);基因orf7则编码Zot类似蛋白。根据已报道的丝状噬菌体基因大小及排布,我们推测基因orf3-orf6可能为衣壳蛋白编码基因,两个反向基因orf8和orf9则可能参与噬菌体基因表达的调控。进化树图谱显示,噬菌体φSHP2与本实验室之前分离的嗜麦芽寡养单胞菌丝状噬菌体φSHP1具有很近的亲缘关系。 嗜麦芽菌素P28,是第一个被分离并鉴定的嗜麦芽寡养单胞菌细菌素。该细菌素具有可收缩且不易弯曲的类似于噬菌体尾部的结构,对胰蛋白酶、蛋白酶K和高温均敏感。杀菌谱分析表明嗜麦芽菌素P28对80株(37株分离自土壤环境,43株分离自临床环境)嗜麦芽寡养单胞菌中的38株(19株分离自土壤环境,19株分离自临床环境)有明显的杀菌活力。 SDS-PAGE分析显示嗜麦芽菌素P28有两种主要结构蛋白,大小约为43kDa和20kDa。随后我们对这两个主要结构蛋白进行了N-端序列测定,并在Smaltophilia P28染色体中克隆了与该细菌素合成相关的基因簇。序列分析比较后推测该基因簇包含有23个ORF,大多数ORF的排布与P2噬菌体基因和R2脓菌素的基因排布类似,其中ORF17和ORF18编码两个主要结构蛋白,分别与P2噬菌体的gpFI(尾鞘蛋白)and gpF Ⅱ(尾管蛋白)相对应。并且我们在大肠杆菌中表达了ORF17编码的蛋白质,并制备了相应的多克隆抗体。 通过基因敲除方法,我们首先缺失了嗜麦芽寡养单胞菌P28染色体上的lexA和recA基因,结果发现缺失菌株的嗜麦芽菌素P28合成不受影响,说明SOS修复系统中的两个主要蛋白LexA和RecA蛋白不参与嗜麦芽菌素P28合成的调控,提示嗜麦芽菌素合成的调控机制与已发现的细菌素合成调控机制明显不同。同时,我们也对嗜麦芽菌素P28合成相关基因簇中的ORF1-ORF7进行了一一敲除,杀菌活性检测、Western blot和RT-PCR分析结果均表明其中的ORF3、ORF5和ORF6可能调控嗜麦芽菌素P28的合成。 总之,本论文分离鉴定了一个新的嗜麦芽寡养单胞菌丝状噬菌体cpSHP2和一个新的类似于噬菌体尾部结构的细菌素嗜麦芽菌素P28,并且对它们的特征进行了详细分析,同时已有的实验结果也提示调控嗜麦芽菌素P28合成的机制是一种新的调控机制。嗜麦芽菌素P28生物安全性高(成分为蛋白质,无核酸)、杀菌活性强、合成产量高,在抗嗜麦芽寡养单胞菌感染医疗制剂的研发中有较大的应用价值。
【关键词】:嗜麦芽寡养单胞菌 细菌素 嗜麦芽菌素 基因簇 生物合成调控
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q93
【目录】:
  • 本研究工作的主要创新点5-9
  • 摘要9-11
  • Abstract11-13
  • 第一章 前言13-35
  • 1.1 嗜麦芽寡养单胞菌的基本生物学特征13-17
  • 1.1.1 嗜麦芽寡养单胞菌的分类地位13
  • 1.1.2 嗜麦芽寡养单胞菌的分布及形态特征13-14
  • 1.1.3 嗜麦芽寡养单胞菌的生化特征14
  • 1.1.4 嗜麦芽寡养单胞菌的机会致病性14-15
  • 1.1.5 嗜麦芽寡养单胞菌的极端耐药性15-16
  • 1.1.6 嗜麦芽寡养单胞菌的遗传学研究现状16-17
  • 1.2 噬菌体17-25
  • 1.2.1 噬菌体的多样性及应用价值17-20
  • 1.2.2 丝状噬菌体的生物学特性20-22
  • 1.2.3 丝状噬菌体DNA的复制方式22-23
  • 1.2.4 丝状噬菌体的基因组23-25
  • 1.3 细菌素25-34
  • 1.3.1 细菌素的基本特性及分类26-28
  • 1.3.2 类似于噬菌体尾部结构的细菌素28-30
  • 1.3.3 细菌素基因表达的调控方式30-32
  • 1.3.4 细菌素的应用价值32-34
  • 1.4 本论文的研究目的和意义34-35
  • 第二章 材料与方法35-58
  • 2.1 实验材料和仪器35-46
  • 2.1.1 菌株和质粒35-37
  • 2.1.2 引物37-40
  • 2.1.3 药品和试剂40-41
  • 2.1.4 培养基和溶液配制41-45
  • 2.1.5 实验仪器45-46
  • 2.2 实验方法46-57
  • 2.2.1 嗜麦芽菌素的纯化46
  • 2.2.2 透射电镜技术46
  • 2.2.3 嗜麦芽寡养单胞菌质粒的提取46-47
  • 2.2.4 SDS-PAGE电泳47-48
  • 2.2.5 Tricine-SDS-PAGE48
  • 2.2.6 N-端测序48
  • 2.2.7 噬菌体核酸提取48-49
  • 2.2.8 双链DNA的合成49
  • 2.2.9 进化树图的绘制49
  • 2.2.10 嗜麦芽菌素杀菌活力检测49-50
  • 2.2.11 嗜麦芽菌素杀菌动力学实验50
  • 2.2.12 嗜麦芽菌素对温度、蛋白酶敏感性实验50
  • 2.2.13 嗜麦芽寡养单胞菌总DNA的提取50-51
  • 2.2.14 嗜麦芽菌素P28基因簇的注释51
  • 2.2.15 嗜麦芽菌素P28尾鞘蛋白抗血清制备51-52
  • 2.2.16 蛋白质浓度的标准曲线制作及细菌总蛋白质浓度测定52
  • 2.2.17 Western blot52-53
  • 2.2.18 酶联免疫吸附实验(ELISA)53
  • 2.2.19 嗜麦芽寡养单胞菌总RNA提取,逆转录PCR53-54
  • 2.2.20 同源重组法敲除目的基因54-56
  • 2.2.21 缺失基因的回补56-57
  • 2.3 核酸序列号码57-58
  • 第三章 丝状噬菌体ΦSHP258-67
  • 3.1 丝状噬菌体ΦSHP2的纯化和形态58-60
  • 3.2 质粒pSH2的序列分析60-63
  • 3.3 质粒pSH2是丝状噬菌体ΦSHP2的双链复制型(RF)63
  • 3.4 丝状噬菌体ΦSHP2的衣壳蛋白63-64
  • 3.5 丝状噬菌体ΦSHP2与其它丝状噬菌体的进化关系64-65
  • 3.6 嗜麦芽寡养单胞菌丝状噬菌体的调控基序65-66
  • 3.7 小结66-67
  • 第四章 嗜麦芽菌素P28的生物学特征67-81
  • 4.1 嗜麦芽菌素P28的杀菌谱和活力67-68
  • 4.2 嗜麦芽菌素P28的杀菌动力学68
  • 4.3 嗜麦芽菌素P28对温度和蛋白酶的敏感性68-69
  • 4.4 嗜麦芽菌素P28的主要结构蛋白69-72
  • 4.5 嗜麦芽菌素P28的基因簇72-79
  • 4.5.1 基因簇的克隆72-73
  • 4.5.2 基因簇序列分析73-76
  • 4.5.3 基因簇正确性验证76-79
  • 4.6 嗜麦芽菌素在嗜麦芽寡养单胞菌中的分布性79-80
  • 4.7 小结80-81
  • 第五章 嗜麦芽菌素P28调控基因的初步鉴定81-101
  • 5.1 通过基因敲除法寻找嗜麦芽菌素P28的调控基因81-93
  • 5.1.1 嗜麦芽寡养单胞菌P28中lexA和recA基因序列的克隆82-83
  • 5.1.2 嗜麦芽寡养单胞菌P28lexA、recA和orf6基因的敲除83-85
  • 5.1.3 嗜麦芽菌素P28基因簇中orf1、orf2、orf3、orf4和orf7的敲除85-90
  • 5.1.4 嗜麦芽菌素P28基因簇中orf5的敲除90-93
  • 5.2 Western blot验证敲除基因的功能93-96
  • 5.2.1 嗜麦芽菌素P28尾鞘蛋白(ORF17)表达载体构建93-94
  • 5.2.2 嗜麦芽菌素P28尾鞘蛋白异源表达94-95
  • 5.2.3 嗜麦芽菌素P28尾鞘蛋白抗血清制备及效价检测95
  • 5.2.4 Western blot检测嗜麦芽寡养单胞菌P28Δorf3、P28Δorf6和P28Δorf4-6中尾鞘蛋白的表达95-96
  • 5.3 RT-PCR检测嗜麦芽菌素P28基因96-99
  • 5.3.1 嗜麦芽寡养单胞菌P28总RNA提取及DNA的去除97
  • 5.3.2 对嗜麦芽菌素P28调控基因及结构基因进行RT-PCR97-99
  • 5.4 小结99-101
  • 研究总结和展望101-103
  • 参考文献103-117
  • 在读期间发表的论文117-118
  • 致谢118

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