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《武汉大学》 2016年
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HIV-1编码的microRNA-TAR和IncRNA MALAT1在HIV-1感染巨噬细胞中的作用研究

李立  
【摘要】:目的: (1)当前有很多研究报道显示病毒编码的miRNAs在病毒复制以及病毒与宿主之间的相互作用中发挥着重要作用。然而关于来源于HIV-1的TAR元件的miR-TAR-3p是否表达及其在病毒复制中的功能研究却很少有文章报道。由此,本文试图研究HIV-1编码的miR-TAR-3p在HIV-1感染的人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞(Monocyte-derived macrophages, MDM)中的表达及其在HIV-1复制中的作用。(2) MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript)是肿瘤中一种常见长链非编码RNA,很少有文献报道MALAT1在外周血分离的MDM中的研究,我们试图利用蛋白质组学研究MDM中的长链非编码RNAMALAT1的功能以及分子机制,而MDM又是HIV-1的靶细胞,我们试图研究MALAT1在HIV-1感染的MDM中的作用。方法:(1)首先利用RT-qPCR检测miR-TAR-3p在HIV-1感染的患者外周血以及MDM中的表达;然后利用合成的miR-TAR-3p mimics和miRNA inhibitor转染进MDM后检测gag基因和p24蛋白的表达;并利用荧光素酶报告基因检测miR-TAR-3p对HIV-1转录的影响;之后再用细胞因子芯片检测miR-TAR-3p对巨噬细胞中细胞因子的影响;最后利用荧光素酶报告基因试验检测HIV-1编码的其他miRNAs对HIV-1转录的影响。 (2)首先利用RT-qPCR证实MALAT1在MDM中的表达;接着利用蛋白质组学检测MDM中MALAT1调控的所有蛋白表达以及相关功能情况;然后利用RT-qPCR检测HIV-1感染之后长链非编码RNA MALAT1和抗病毒miR-125b的表达量变化;最后转染MALAT1 siRNA之后,检测MDM中MALAT1和抗HIV-1感染的miR-125b的表达情况。结果: (1)我们检测到HIV-1感染病人外周血中以及细胞模型中有miR-TAR-3p的表达。合成的miR-TAR-3p mimics明显抑制HIV-1在巨噬细胞中的复制,合成的miR-TAR-3p Inhibitor mimics明显促进了HIV-1在巨噬细胞中的复制。双荧光素酶报告基因实验显示miR-TAR-3p通过结合5'LTR的TAR元件来抑制HIV-1的转录。利用细胞因子芯片技术来筛选有表达变化的细胞因子时,没有发现有明显变化的细胞因子。HIV-1编码的miR-N367以及miR-TAR-3p可以抑制HIV-1基因组的转录,而miR-H1对HIV-I基因组的转录没有影响。(2)RT-qPCR结果显示长链非编码RNA MALAT1在MDM中有表达。利用蛋白质组学研究MALAT1调控的蛋白,总共鉴定到4709个蛋白,包括26个上调的差异蛋白和51个下调的差异蛋白,其中STAT1的表达量明显下调,GO功能注释显示和signaling, viral reproduction相关。HIV-1感染的MDM中MALAT1表达量上升,而miR-125b表达量下降。干扰MALAT1表达的MDM中,STAT1表达量下降,miR-125b表达量上升。结论:(1)我们的研究揭示了HIV-1编码的miR-TAR-3p存在于HIV-1感染的病人外周血以及巨噬细胞中,功能研究显示miR-TAR-3p可能作为负调控因子调控HIV-1的复制。 (2)我们的研究发现MALAT1在巨噬细胞中可能发挥着重要的抗病毒免疫作用,也发现MALAT1在HIV-1感染中可能扮演重要角色。这可能对于后期利用MALAT1作为一个HIV-1潜在的治疗靶点提供理论基础。
【关键词】:HIV-1 microRNA-TAR-3p 抗病毒作用 单核细胞衍生的巨噬细胞 MALAT1 蛋白质组学
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R512.91
【目录】:
  • 中文摘要8-10
  • Abstract10-13
  • 前言13-15
  • 第一部分 HIV-1编码的microRNA-TAR在HIV-1感染的巨噬细胞中的作用研究15-60
  • 1. 引言15-18
  • 2. 材料与方法18-34
  • 3. 结果34-56
  • 4. 讨论与展望56-60
  • 第二部分 长链非编码RNA MALAT1在巨噬细胞中的作用研究60-88
  • 1. 引言60-62
  • 2. 材料与方法62-69
  • 3. 结果69-84
  • 4. 讨论与展望84-88
  • 参考文献88-96
  • 综述96-114
  • 参考文献107-114
  • 已发表及待发表论文114-115
  • 后记115

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