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《华中科技大学》 2016年
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乙醇—乌头碱联合染毒对心肌细胞钙稳态及RyR2-ser2808磷酸化影响的研究

李浩然  
【摘要】:【研究背景】在我国乌头、附子及雪上一支蒿等76种乌头属植物被中医学一直沿用至今。乌头碱是乌头属植物中的主要有效成分,在强心、治疗风湿、缓解疼痛、抗肿瘤及免疫抑制等方面具有医用价值。但是乌头碱也具有心脏毒性及神经毒性,它可以引起中枢神经和呼吸中枢抑制,同时引起多种心律失常,如室性心动过速、房室传导阻滞及室性纤颤等。而恶性心律失常是乌头碱中毒者最终死亡的主要原因。在民间用乌头属植物浸泡药酒进行止痛、强身的习惯,但是每年都有因饮用乌头药酒中毒甚至死亡的案件发生。虽然少数研究从毒物代谢学角度提出乙醇能增加乌头碱等有毒成分的溶解度,促进其吸收,但未有研究探索两者对心脏产生的毒性效应的相互关系及具体作用机制。研究显示电压门控钙离子通道包括雷诺定受体(Ryanodine receptor 2,RyR2)易被乌头碱及乙醇影响而发生改变。钙稳态破坏及RyR2-ser2808被过度磷酸化会引起心律失常及心力衰竭。目前尚未有关于乙醇-乌头碱联合染毒对心肌细胞钙稳态及RyR2-ser2808蛋白磷酸化影响的相关研究报道。【目的】研究乙醇-乌头碱联合染毒对心肌细胞钙稳态及RyR2-ser2808磷酸化影响相关性问题。为进一步探索乙醇和乌头碱毒性效应的相互关系及具体作用机制指明道路,为临床医学及药学制作有效解毒剂提供理论基础,为法医学获取更便捷的检测手段提供可能性。【材料与方法】选取来自动物中心的1-3天SPF级大鼠的乳鼠,按照无菌操作要求剪取心脏,心室肌组织采用由胰酶、胶原酶、及牛血清蛋白组成的消化液进行消化,悬浮细胞采用差速贴壁法及5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine,5-brdu)抑制成纤维细胞法进行纯化,采用co2培养箱培养5-6天完成原代心肌细胞培养。心室肌细胞分成5组并进行染毒。对照组为无血清培养基组(a组),乌头组为1.0μmol/l乌头碱染毒组(b组),乌头碱+乙醇组为1.0μmol/l乌头碱及乙醇联合染毒组(c组),其中c组分c1、c2及c3共三组,即1.0μmol/l乌头碱+5mmol/l乙醇染毒组(c1组),1.0μmol/l乌头碱+50mmol/l乙醇染毒组(c2组),1.0μmol/l乌头碱+100mmol/l乙醇染毒组(c3组)。急性染毒心室肌细胞培养的时间为1小时。后各组分别进行westernblot检测和激光共聚焦显微镜的观察。westernblot检测ryr2-ser2808磷酸化蛋白及pka蛋白的表达情况。5组心室肌细胞进行fluo-4探针标记后通过激光共聚焦显微镜检测从而观察钙稳态的情况。【结果】采用本方法可以得到较高纯度并满足相关实验要求的心室肌细胞。使用cck-8检测试剂盒检测细胞活性,通过与对照组对比,显示1μm的乌头碱可以降低其活性。除加入1μm乌头碱外,同时加入乙醇的干预后,显示其活性与乙醇的浓度有关。通过激光共聚焦检测,除对照组外其余组的未出现典型钙火花现象,钙振荡振幅减小,钙稳态破坏。1μm的乌头碱染毒组(b组)与对照组相比,其心室肌细胞的pka蛋白表达量升高。与1μm的乌头碱染毒组对比,中及高浓度的乙醇及乌头碱联合染毒可以使pka蛋白表达量升高,但低浓度的乙醇无统计学意义。1μm的乌头碱可以使ryr2-ser2808磷酸化蛋白表达量升高。与1μm的乌头碱染毒组对比,中及高浓度的乙醇与1μm乌头碱联合染毒ryr2-ser2808蛋白磷酸化表达量显著升高。【结论】1μm乌头碱可以通过影响钙振荡破坏钙平衡。溶于中、高浓度的乙醇的乌头碱可以进一步破坏钙振荡及钙稳态。同时乌头碱及溶于中、高浓度的乙醇的乌头碱影响ryr2-ser2808蛋白磷酸化水平(升高)及pka的蛋白表达上调。pka蛋白结果与ryr2-ser2808蛋白磷酸化水平结果相互印证,支持pka介导ryr2-ser2808蛋白磷酸化的观点。乌头碱及中、高浓度的乙醇都具有心脏毒性,能降低心肌细胞活力。溶于中、高浓度乙醇的乌头碱其可通过影响ryr2-ser2808蛋白磷酸化水平途径,破坏钙稳态,产生各种恶性心律失常。该途径可能是乌头碱与乙醇联合作用于心脏的毒理学机制之一,其引起心率失常的作用机制需要继续探索。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:D919

【参考文献】
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