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《华中农业大学》 2016年
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番茄锌指蛋白家族基因分析与功能研究

储转南  
【摘要】:番茄(Solanum lycopersicum)是全球最重要的蔬菜作物之一,在我国蔬菜产业中同样占据重要地位。番茄同时也是基础研究的重要模式植物之一。利用番茄来揭示植物的发育和抗逆等机制,对于基础研究和遗传改良均有重要意义。本课题组前期研究中,通过对潘那利野生番茄(Spennellii,LA0716)为供体、栽培番茄(S.lycopersicum,M82)为受体的两个耐早渐渗系开展干旱胁迫相关的芯片研究,发现几个差异表达基因编码DBB(Double B-BOX)类锌指蛋白,这些DBB属于锌指蛋白转录因子B-BOX(BBX)家族。BBX基因在拟南芥和水稻上均有相关研究,而在番茄中尚无报道。本研究中的另一个锌指蛋白基因为SlZF3,前期的盐胁迫芯片研究表明该基因受盐胁迫诱导。超量表达SlZF3导致番茄植株出现矮化等发育方面的改变,抗逆性提高。本研究旨在对番茄BBX锌指蛋白基因进行系统分析,并对SlZF3在发育和抗逆方面的功能及相关机理进行解析。主要的研究结果如下:1番茄B-BOX基因家族全基因组分析B-BOX蛋白编码一类拥有1个或2个B-BOX结构域、有的还包含1个CCT(CO,CO-likeandTOC1)保守域的锌指蛋白转录因子,它们在植株的生长发育及逆境响应中起着重要的调控作用。不过,迄今为止,BBX基因在番茄中还没有系统研究过。本研究对番茄的BBX基因家族29个成员进行了全基因组分析,包括基因结构、保守域、聚类、亚细胞定位、启动子顺式元件预测等方面。同时利用实时荧光定量PCR对番茄各组织器官、激素诱导和逆境处理中的BBX基因表达模式进行了分析。番茄BBX家族基因可划分为5个亚家族,它们中的12个成员存在片段复制。大多数BBX基因的表达模式都有时间和空间上的特异性,如SlBBX24在几乎所有的组织中呈组成型高表达,而另外8个基因(SlBBX4、5、6、11、16、18、19和22)则在营养器官(根、茎、叶)及未成熟的果实中表达量相对较高。大多数SlBBX基因都受干旱、聚乙二醇或热处理诱导。一些BBX基因受到脱落酸、赤霉素或乙烯的强烈诱导。大多数番茄BBX蛋白经预测定位于细胞核中,利用拟南芥原生质体瞬时表达实验,证明所候选的7个BBX蛋白(SlBBX5,7,15,17,20,22和24)均定位于细胞核。全基因组范围的BBX家族成员分析将为进一步深入研究基因功能奠定良好的基础。2超表达SlZF3导致番茄植株矮化的机理解析课题组前期研究从耐盐芯片数据中候选出一个盐诱导锌指蛋白基因S1ZF3。它编码类似ZAT12的C2H2型锌指蛋白,该蛋白含有两个核定位信号肽(NLS)和一个EAR抑制结构域。拟南芥原生质体瞬时表达实验表明SlZF3蛋白定位在细胞核中。超表达SlZF3的转基因番茄幼苗下胚轴明显短于非转基因对照,植株全生育期表现为矮化、叶片变小并增厚。石蜡切片分析表明,超表达植株的矮化表型是由于茎节间细胞短缩所致。进一步分析表明植株矮化的表型能够通过外源喷施赤霉素GA3恢复。基因表达分析发现GA合成途径中的关键基因在转基因系中的表达量有显著改变。SlCPS、SlKS、SlKO、SlKAO和SlGA20oxs(2、3和4)的表达均显著下调,而GA2oxs(2、3和5)的表达则明显上调。这些可能导致转基因系中内源赤霉酸含量下降,使超表达植株出现矮化等发育表型变化。3番茄SlZF3在AsA积累及逆境胁迫抗性中的机理解析抗坏血酸(AsA)是一种重要的抗氧化剂,对清除活性氧(ROS)起着关键作用,进而提高植物的抗逆性。尽管AsA的生物合成及代谢途径己经得到了深入研究,但有关AsA调控方面的研究仍然不多。研究发现SlZF3受盐胁迫和干旱快速诱导,S1ZF3能够通过靶定甘露糖焦磷酸化酶来调节AsA的生物合成。蛋白互作分析实验证明S1ZF3能够与甘露糖焦磷酸化酶VTC1竞争结合COP9信号复合体的亚基CSN5B,从而正调控拟南芥和番茄中AsA的生物合成。酵母和植物细胞中的互作研究中发现,EAR结构域不是S1ZF3与CSN5B互作所必须的,但它对SlZF3蛋白的稳定有重要作用。因此,在拟南芥和番茄中超量表达SlZF3能够显著提高AsA含量,植株清除ROS的能力增强,进而提高了植物对盐害和干旱的抗性。这些结果可能为提高抗坏血酸含量和增强植物抗逆性提供一条新的途径。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S641.2

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