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《海南大学》 2018年
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CRISPR在E.coli基因编辑与GBS消除中的研究

侯国锋  
【摘要】:CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)是细菌的自身免疫系统,经改造后在细菌基因编辑、耐药基因清除与病原菌防治方面都有很大的应用价值。为进一步提高现有CRISPR技术在细菌中的应用效率和高通量基因编辑能力,本研究通过联合CRISPR基因编辑系统和Red基因重组系统,以构建一套更加高效、简单、快捷的双质粒大肠杆菌基因编辑工具;同时,利用不同细菌间可以分泌、传递膜泡(membrane vesicles,MVs)的特点,通过构建CRISPR的单穿梭质粒,以大肠杆菌为质粒供体,探究CRISPR系统对无乳链球菌菌株的消除能力。在基因编辑方面,本研究首先将携带靶点的pCRISPR质粒与重组ssDNA或dsDNA 一起导入含有pKD46与pCas9质粒的大肠杆菌中,通过实验验证Red与CRISPR系统的结合的可行性。然后,本课题对传统质粒进行改造得到新双质粒:pKS9/pCSK,并且用新构建的双质粒系统对大肠杆菌的galK与laccZ基因进行点突变、基因敲除、插入等一些列的实验进行高通量基因编辑的验证。在病原菌防治方面,利用膜泡为运载体,通过构建得到的单质粒pCas9-cfb消除无乳链球菌。验证了三质粒系统可行后,通过对CRISPR的系统的改造,本课题构建了pKS9、pCSK新双质粒系统,新系统极大的提高基因编辑效率并且简化实验操作,点突变效率提升到95%以上,片段重组效率也提高到60%以上,不需要插入抗性基因就可以筛选得到基因编辑成功的菌株;用ssDNA或PCR产物就可完成基因编辑,省去了构建打靶载体的时间;新系统可以实现质粒的自我消除,避免了对后续实验的影响。通过膜泡传递实验,实现了 pCas9-cfb质粒以膜泡传递进入到无乳链球菌中并且杀死无乳链球菌的目的。实验结果证明CRISPR在微生物的基因编辑与病原菌防治中都有着重要的应用价值。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q78

【参考文献】
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