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《重庆大学》 2018年
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纳米介孔硅及聚合物胶束智能药物递送系统制备与抗肿瘤效应研究

戴亮亮  
【摘要】:恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。传统临床手术、放疗及化疗治疗手段仍存在诸多缺陷,如易复发、无靶向特异性、多药耐药性及严重毒副作用等,因而较难彻底根治肿瘤,尤其对晚期肿瘤疗效甚微。纳米颗粒药物载体由于其独特的增强渗透性和滞留性(EPR)效应,在提高抗肿瘤药物生物利用率、增强疗效以及减少毒副作用方面发挥着重要作用,有广阔的临床应用前景。目前,已开发出基于脂质体、无机纳米颗粒和聚合物胶束的多种抗肿瘤纳米医药制剂。智能药物递送系统就是其中的佼佼者,该体系可以选择性的将治疗药物靶向递送到肿瘤病灶,原位响应生物信号刺激释放化疗药物/光敏剂/siRNA。兼顾生物相容性的前提下,智能药物递送系统能够对肿瘤高效地杀伤且毒副作用小,在临床上有巨大的应用前景。智能药物递送系统一般是以纳米颗粒为药物载体,通过多功能修饰手段整合诸如刺激响应性释放机制以及靶向分子等策略来构建。介孔硅纳米颗粒以及聚合物胶束作为其中的典型代表,受到了研究人员的广泛关注。介孔硅纳米颗粒具有合成简单、高比表面积、粒径可调和易修饰等特点,作为纳米储存器被广泛开发及应用到药物递送和生物成像等医学领域。聚合物胶束由于其良好的生物相容性、低免疫原性、高药物装载量以及可降解等优点,在靶向递送药物/基因治疗肿瘤等方面有巨大的应用前景。但仍存在一些亟待解决的问题:1.如何构建有高载药量和良好生物相容性的生物信号响应性介孔硅靶向药物递送系统,使其特异性的靶向肿瘤病灶,在肿瘤微环境特有生物信号的刺激下,原位递送化疗药物特异性地杀伤肿瘤,在提高药物利用率的同时减少对正常组织的副作用;2.如何设计构建有良好生物相容性和刺激响应性的可降解聚合物胶束靶向药物递送系统,实现对肿瘤的特异性靶向及提高肿瘤细胞对载体的摄取效率,使其被摄取后能够有效地从溶酶体逃逸到胞浆,并且响应性的触发载体降解和化疗药物/功能性治疗分子的释放机制,对肿瘤组织高效杀伤。基于以上问题,本文设计合成了三种纳米介孔硅及三种可降解聚合物胶束,通过多功能化修饰手段整合生物信号刺激响应性释放/降解机制以及引入肿瘤靶向基元,共构建了六种硅纳米颗粒/聚合物胶束药物递送系统,较系统地研究了各体系体内外刺激响应性药物释放特性、细胞靶向、生物成像、免疫响应、肿瘤抑制及相关分子机制,为研发靶向药物递送系统提供科学依据。本文的主要研究内容和结论如下:一、基于纳米介孔硅颗粒响应性药物递送系统的构建及抗肿瘤研究1.还原响应性介孔硅/肝素药物递送系统构建及抗肝肿瘤评价本章构建了以MSN为纳米储存器,二硫键为分子开关、肝素作为纳米塞、乳糖酸作为靶向基元的还原响应性靶向药物递送系统(MSNs-S-S-HP-LA)。透射电镜、热重、Zeta电位、红外光谱和比表面及孔隙度表征证实已成功构建MSNs-S-S-HP-LA靶向药物递送系统。药物控释实验证实该体系有还原敏感的控释特性。细胞毒性实验表明该体系有良好的生物相容性。激光共聚焦、流式细胞仪、细胞透射及凝胶电泳DNA片段测定实验表明该靶向药物递送系统可以被肝肿瘤细胞HepG2特异性识别并摄取。在肿瘤细胞内高浓度GSH的刺激下,释放装载的抗肿瘤药物阿霉素DOX,有效地杀伤肿瘤细胞。体内实验证实该体系可以有效抑制肿瘤生长并减少化疗药物的毒副作用。2.pH响应性枝状介孔硅药物递送系统构建及抗肝肿瘤、生物成像评价基于MNS功能单一的问题,本章以有多级孔结构的枝状介孔硅纳米颗粒(HPSN)为纳米载体,有荧光性质的N,N-亚苯基双(亚水杨基亚胺)二羧酸(Salphdc)与铟离子二者形成的共价聚合物为有机大分子纳米塞,叶酸作为靶向分子,构建了有生物成像和肿瘤靶向功能的pH响应性药物递送系统(HPSN-Salphdc-FA)。透射电镜、扫描电镜、动态光散射光谱、Zeta电位、核磁光谱及红外光谱等诸多表征数据表明已经成功构建了HPSN-Salphdc-FA药物递送系统。药物释放实验表明该体系有pH敏感的控释特性。激光共聚焦、吞噬机制、细胞透射电镜以及流式实验证实肝肿瘤细胞通过受体介导的方式特异性地胞吞HPSN-Salphdc-FA,该体系能响应性释放DOX杀伤肝肿瘤细胞且有剂量依赖的细胞毒性。体内实验表明该体系能有效地抑制肿瘤生长且对正常组织无明显副作用,同时该系统有良好的生物成像功能。3.pH响应性中空介孔硅/透明质酸药物递送系统构建及抗肝肿瘤评价为提高MSN药物递送系统的载药量,本章以中空介孔硅纳米颗粒(HMSNs)为药物载体,腙键为递送开关,透明质酸为纳米塞及靶向分子,构建了pH响应性中空介孔硅/透明质酸靶向药物递送系统(HMSNs-PA-HA)。透射电镜、扫描电镜、核磁/红外光谱、热重以及Zeta电位分析均表明已成功构建HMSNs-PA-HA靶向药物递送系统。药物释放实验表明该体系有良好的封装特性和pH敏感的控释特性。激光共聚焦、流式细胞仪、细胞活性以及细胞透射电镜结果证实肝肿瘤细胞通过CD44介导的胞吞路径对该靶向药物递送系统高效摄取,该体系能响应胞内低酸刺激快速释放DOX杀伤肝肿瘤细胞且有剂量依赖的细胞毒性。体内实验证实该体系能主动靶向肿瘤组织,有效地抑制肿瘤生长且有良好生物相容性。二、基于可降解聚合物胶束响应性药物递送系统的构建及抗肿瘤研究1.ROS响应性聚合物胶束药物递送系统的构建及在光动力-化药联合治疗肝肿瘤中的应用本章以聚硫化丙烯为疏水段,PEG为亲水段,叶酸为肿瘤靶向分子,构建了有肿瘤靶向和可降解性能的ROS响应性胶束药物递送系统(PPS-mPEG-Ser-FA)。核磁光谱、凝胶渗透色谱、质谱及透射电镜分析表明PPS-mPEG-Ser-FA嵌段聚合物已逐步成功合成且制备胶束颗粒有适宜的尺寸(~80 nm)、低的临界胶束浓度及良好的稳定性。透射电镜、动态光散射分析、核磁光谱以及释放实验证实PPS-mPEG-Ser-FA@DOX@ZNPC胶束有ROS敏感的可降解及控释特性。激光共聚焦、流式细胞仪、细胞活性以及蛋白电泳分析结果表明肝肿瘤细胞通过受体介导的路径特异性地摄取该复合胶束,载药胶束能响应胞内ROS刺激降解并释放药物,诱导肿瘤细胞凋亡。另外,激光照射能有效地产生ROS,加速胶束降解及增强肿瘤细胞凋亡。体内实验结果表明该体系能主动靶向肿瘤,通过光动力-化药联合治疗显著地抑制肿瘤生长且无明显副作用,同时有效地延长了荷瘤裸鼠的存活时间。2.双靶向级联响应性前药胶束药物递送系统的构建及在光动力-化药联合治疗宫颈癌中的应用本章构建了双靶向级联响应性聚合物胶束药物递送系统(FA-PEG-PDBO-BPT),该体系由二硫键连接的喜树碱前药,有质子化功能的多叔胺聚合物PDEA,双亲分子PEG以及靶向分子叶酸构成。本研究还合成了一种线粒体靶向光敏剂MTPP,使其负载到药物递送系统。核磁光谱、质谱、凝胶渗透色谱、高效液相色谱、透射电镜结果表明FA-PEG-PDBO-BPT聚合物和MTPP已逐步成功合成且制备的胶束有适宜尺寸,良好稳定性以及较低临界胶束浓度。透射电镜、核磁光谱以及药物释放实验证实该体系有pH响应性质子化,还原响应性CPT前药释放,级联响应性胶束降解及药物释放特性。激光共聚焦、流式细胞仪、凋亡检测分析表明该体系被宫颈癌细胞通过受体介导的胞吞机制高效摄取,载药胶束能响应胞内低酸和GSH刺激触发溶酶体逃逸,响应性降解和释放药物。释放的MTPP能够靶向线粒体,利用PDT诱导线粒体损伤且激活其介导的凋亡通路,同CPT共同作用高效杀伤肿瘤。体内实验结果表明该体系能主动肿瘤,提高CPT的生物利用度,通过光动力-化药联合治疗显著地抑制肿瘤生长、减少CPT副作用、延长小鼠存活时间,有良好的抗肿瘤作用。3.pH响应性尺寸/电荷可调胶束的构建及在光动力-PD-L1免疫联合治疗黑色素瘤中的应用本章制备了pH响应性尺寸/电荷可调的胶束药物递送系统,使其负载PD-L1干扰RNA(siPD-L1)和MTPP,通过抑制免疫逃逸和激活免疫应答的方式介导增强肿瘤免疫治疗。该复合胶束由两条嵌段聚合物PEG-CDM-PDEA和PEI-PDEA以1.5:1比例制备而成。核磁光谱、凝胶渗透色谱以及透射电镜结果表明两条嵌段聚合物已逐步成功合成且制备的复合胶束有适宜尺寸,良好稳定性以及较低临界胶束浓度。透射电镜、核磁光谱以及药物释放实验证实该体系有pH响应性尺寸减小,正电荷增加,胶束降解及药物释放特性。激光共聚焦、流式细胞仪、凋亡检测分析表明该体系能增强肿瘤渗透,提高细胞摄取,响应胞内低酸刺激触发溶酶体逃逸,响应性降解和释放药物,释放的siRNA和MTPP能高效沉默PD-L1表达且杀伤肿瘤细胞。体内实验结果表明该体系通过光动力-PD-L1免疫联合治疗既能抑制PD-L1介导的免疫耐受,又能激活抗肿瘤免疫应答,二者共同作用诱导机体免疫系统高效杀伤肿瘤并抑制肿瘤转移。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R943;R96

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