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《重庆大学》 2018年
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Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制

张康  
【摘要】:心血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病,世界卫生组织统计结果显示全球范围内每年有一千多万人死于心血管疾病,占死亡总人数的30%,心血管疾病已是全球第一致残致死疾病。我国2016年心血管疾病报告指出中国心血管疾病患者数量呈持续上升趋势,其死亡率高于肿瘤等其他疾病,居于首位。即使应用目前最先进、完善的治疗手段,仍有50%以上的心血管疾病幸存者生活不能完全自理。导致心血管疾病发生的主要原因是血管动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)引起的动脉梗阻或狭窄,因此深入研究动脉粥样硬化的形成机制对提高心血管疾病的防治具有至关重要的意义。动脉粥样硬化是一种高度偏好性的血管疾病,它多发于动脉血管弯曲与分叉位置,这些位置多为血流流场紊乱的低震荡切应力区域,这说明动脉粥样硬化的形成和发展与血流动力学因素密切相关。目前研究发现血流流场紊乱引发的血管壁细胞结构和功能的改变是导致AS形成的重要因素。血管内皮细胞对脂质摄取过多会导致脂质在动脉内膜下沉积,促进动脉粥样斑块的形成,故内皮细胞对脂质的摄取量在AS形成中也起着至关重要的作用。有研究显示血管壁脂质沉积与血流流速及切应力可能存在相关性,但其具体的调控机制并不清楚,所以本研究以低震荡切应力为主线,研究其对血管内脂质摄取及沉积的影响及相关分子机制,这将有助于解析切应力影响AS发生发展的生物学机制,并且有可能为AS的治疗提供潜在的新靶点。在本课题研究中,通过对Apo E~(-/-)小鼠颈总动脉进行结扎手术构建了小鼠低震荡切应力模型,并通过小动物超声检测其血流状态以确保模型构建成功。通过蛋白组学方法检测了低震荡切应力与层流切应力下血管组织蛋白的差异表达情况,并进行了相关信号通路分析,发现低震荡切应力可能通过影响脂质吸收及炎症反应等过程影响AS的发生发展。进一步构建Apo E~(-/-)小鼠低震荡切应力模型检测其血管内斑块形成、脂质堆积、内皮细胞脂质吸收等情况,并通过在体及体外实验研究了Id1蛋白在低震荡切应力引起的脂质吸收过程中的作用及相关分子机制。主要研究内容和结论如下:1.构建Apo E~(-/-)小鼠颈动脉低震荡切应力模型,并通过小动物超声方法检测其颈动脉血流流速,结果显示对左颈动脉分支进行结扎后,左颈总动脉血管内血流流速降低并且出现两个呈相反方向的血流,此时血管内的切应力为往复的低震荡切应力,而对侧进行假手术的右颈总动脉血管内为单一方向的血流,血管内的切应力为层流切应力。分别提取了两侧颈动脉血管的总蛋白,通过iTRAQ方法检测层流切应力及低震荡切应力下血管差异蛋白表达谱,结果显示相对于层流切应力,低震荡切应力下有168个差异表达蛋白,其中150个蛋白上调,18个蛋白下调。通过GO富集分析及KEGG信号通路分析方法对这些蛋白的功能及涉及的信号通路进行分类及预测,结果显示这些差异蛋白与大分子代谢和运输过程、脂肪消化及吸收过程以及炎症反应等密切相关,暗示低震荡切应力可能通过调控这些过程影响AS的形成。由于脂质代谢异常与AS发生密切相关,所以我们后续将进一步通过在体及体外实验验证低震荡切应力是否可以影响血管内的脂质沉积吸收从而促进斑块形成。2.对Apo E~(-/-)小鼠颈动脉低震荡切应力模型进行血浆脂蛋白检测,发现手术形成的低震荡切应力对小鼠血液中的脂蛋白含量没有明显的影响。通过对小鼠左颈及右颈动脉血管组织进行HE染色后发现随着时间的增加,进行了结扎手术的左颈总动脉血管(低震荡切应力)内膜逐渐增厚,到第10周时AS斑块几乎堵塞整个血管,而对侧右颈动脉(层流切应力)以及对照组血管(层流切应力)内膜厚度没有明显变化。对颈总动脉血管进行油红O染色后发现低震荡切应力可以促进血管壁脂质堆积,并且随着结扎时间的增加,脂质堆积越来越严重。对颈总动脉血管组织切片进行CD31及BODIPY荧光染色检测血管内皮细胞中的脂质吸收情况,结果显示进行结扎手术后的左颈总动脉(低震荡切应力)内皮细胞吸收的脂质明显高于对侧的右颈动脉(层流切应力)及对照组颈总动脉(层流切应力)内皮细胞,并且随着结扎时间的延长,低震荡切应力组的血管内皮细胞吸收的脂质也越来越多。对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行力学加载后检测其脂质吸收情况,结果显示低震荡切应力能够促进内皮细胞对脂质的吸收,这与在体实验结果一致。将力学处理及LDL吸收后的细胞与THP-1细胞进行共培养,发现低震荡切应力处理及随后的LDL吸收可以促进内皮细胞与THP-1细胞的粘附,而Ki67免疫荧光染色实验说明低震荡切应力处理及随后的LDL吸收可以促进内皮细胞增殖。低震荡切应力及随后的LDL吸收引起的内皮细胞增殖及炎症反应可能参与了AS形成过程。3.我们实验室已有研究暗示分化抑制因子1(Id1)蛋白是力学敏感的转录因子并且与脂质代谢过程密切相关,所以我们以Id1为研究对象,分析其是否参与了OSS调控的脂质吸收过程。对结扎24小时及48小时的小鼠颈动脉进行en face染色检测Id1蛋白在血管内皮细胞中的表达情况,我们发现低震荡切应力抑制Id1蛋白的表达。对人脐静脉内皮细胞进行体外力学加载后,Western blot检测Id1蛋白的表达情况,结果显示层流切应力促进Id1蛋白的表达,并且随着加载时间的延长,蛋白表达量也逐渐增加,到第12小时表达量达到顶峰,而低震荡切应力下,Id1蛋白表达瞬间增加,但随着加载时间的延长,Id1蛋白的表达最终受到抑制。对Id1过表达细胞进行体外力学加载并检测细胞内脂质吸收情况,结果显示Id1过表达能够抑制低震荡切应力调控的脂质吸收过程。4.为了解析Id1通过何种机制参与低震荡切应力调控的脂质吸收过程,我们使用IPA软件进行了相关预测分析,结果发现在AS形成过程中,Id1调控了许多炎症因子,如NF-κB、TNF、ICAM等的表达,此外,Id1还与脂质代谢相关蛋白关系密切,可能调控了低密度脂蛋白受体LDLR的表达。基于此,我们通过在体及体外实验研究了Id1是否会通过调控LDLR的表达影响细胞脂质吸收过程。对人脐静脉内皮细胞中的Id1蛋白进行过表达及干扰处理后检测LDLR的蛋白水平,发现Id1过表达后LDLR蛋白表达被抑制,细胞脂质吸收降低;而Id1被干扰后LDLR蛋白表达明显增加,细胞脂质吸收也显著增加。同时干扰Id1及LDLR后,Id1干扰导致的脂质吸收被抑制,这说明Id1异常表达导致的脂质吸收变化是通过调控LDLR蛋白实现的。在体en face染色及体外Western blot检测了层流切应力及低震荡切应力下LDLR的表达情况,结果显示低震荡切应力促进LDLR蛋白表达,体外结果发现层流切应力下LDLR表达瞬间增加,但随着加载时间的延长,其表达则被抑制,而低震荡切应力可以持续激活LDLR蛋白的表达。将LDLR干扰后,低震荡切应力诱导的脂质吸收被抑制,说明低震荡切应力通过调控LDLR的表达影响细胞对脂质的吸收。体外免疫荧光及Western blot实验检测了LDLR及Id1的表达模式,与静态相比力学加载24小时后,层流切应力促进Id1的表达而抑制LDLR的表达;相反,低震荡切应力抑制Id1的表达而促进LDLR的表达,说明Id1及LDLR均受到低震荡切应力调控,且呈负相关趋势。对Id1过表达细胞进行力学加载后,检测细胞内LDLR的表达情况,结果显示Id1过表达抑制了低震荡震荡切应力对LDLR的促进作用,说明Id1参与了低震荡切应力对LDLR的调控过程。由于Id1蛋白需要通过与b-HLH蛋白相结合才能起作用,所以我们检测了调控LDLR表达的转录因子SREBP1(属于b-HLH蛋白家族成员)与Id1的关系,Western blot结果显示Id1过表达及干扰细胞中SREBP1的蛋白表达没有明显变化,而免疫共沉淀及荧光共定位结果显示Id1与SREBP1存在物理上的结合,这种物理的结合可能参与了Id1对LDLR的调控过程。综上所述,本研究综合运用蛋白组学、生物力学、病理生理学、细胞分子生物学等方法,通过构建小鼠颈动脉结扎模型,研究低震荡切应力对血管脂质沉积、脂质吸收及斑块形成的影响,同时结合体外实验研究了OSS引起的脂质吸收过程中Id1蛋白的作用。本研究工作一定程度上阐明了Id1参与低震荡切应力调控血管内皮细胞脂质吸收的分子机制,这将为深入了解和认识AS易发生在血管低震荡切应力区域提供一些新的科学依据。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R318.01;R543.5

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