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《重庆大学》 2017年
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微柱阵列基底上肝细胞TRPV通道响应及PI3K/Akt通路在肝细胞生长中的作用研究

罗南书  
【摘要】:肝脏是人体新陈代谢和合成转化的重要器官,是最主要的药物代谢器官。肝细胞的体外仿生培养在生物人工肝及药物筛选中具有举足轻重的作用,传统二维培养的肝细胞在形态及功能上与体内细胞存在较大差异,而基底图式化结构可在一定程度上模拟体内细胞力学微环境,改善细胞性状和功能。因而采用何种形状及尺寸的基底图式化结构培养细胞是有关体外细胞培养研究的重要内容之一。此外,基底图式化结构通过何种途径调控细胞的生物学响应过程,也是学者研究的另一重要内容。基底图式化结构已应用于以肝细胞为基础的细胞微系统及生物反应器研究中,但研究大部分是关于利用图式化结构形成肝细胞聚集体以优化肝细胞功能的,而对于肝细胞-基底相互作用的研究较少,且仅为生物学行为响应的现象研究,对于图式化结构基底上肝细胞的信号传导过程少有研究。为解决此问题,了解肝细胞对微图式化结构基底的生物学响应过程中的信号机制,本研究从肝细胞钙离子通道和磷酸肌醇信号通路着手,探讨了图式化结构条件下肝细胞的黏附、增殖等功能随培养时间的响应情况及其可能的作用机制。研究采用软光刻技术制备了微柱直径分别为4μm和10μm,微柱间距分别为4μm和10μm,微柱高度为4μm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微柱阵列型结构基底,经完全培养基裱衬后培养HepG2细胞,观察了肝细胞在图式化结构基底上的形态、黏附、辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid receptor,TRPV)通道、增殖及合成与解毒功能表型响应情况,并利用肌醇磷脂信号通路特异性抑制剂检测了PI3K/Akt信号通路在肝细胞对图式化结构基底的生长响应中的作用。本研究可应用于基于肝细胞的高通量药物筛选及肝组织工程外植体的构建。HepG2细胞接种后在微柱阵列结构基底上呈单层铺展生长,在较小直径微柱阵列结构基底上细胞极化程度较高而铺展程度较低;在较大直径微柱阵列结构基底上细胞铺展程度较高。对vinculin进行免疫荧光染色发现,微柱阵列结构基底上肝细胞的黏着斑数量较少,但平均面积较大,暗示微柱阵列结构基底通过促进细胞黏着斑蛋白的表达以及成熟黏着斑的形成而促进肝细胞对基底的黏附。对磷脂酰肌醇4,5二磷酸(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)进行荧光染色发现,微柱阵列结构基底上肝细胞PIP2的表达降低,暗示微柱阵列结构促进了肝细胞PIP2的降解。利用定量PCR技术检测辣椒素受体1(Transient receptor potential vanilloid receptor 1,TRPV1)和辣椒素受体4(Transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)基因的表达,以及对TRPV1和TRPV4通道蛋白进行荧光染色发现,微柱阵列结构基底促进了肝细胞TRPV1和TRPV4通道基因和蛋白的表达,且在相同微柱直径条件下,较大微柱间距阵列结构基底上肝细胞TRPV1和TRPV4基因表达量更高;在相同微柱间距条件下,较大微柱直径阵列结构基底上肝细胞TRPV1和TRPV4基因表达量更高。用Calcium Green-1标记胞内钙离子发现,微柱阵列结构基底增强了肝细胞TRPV1和TRPV4通道的功能响应。微柱阵列结构基底上肝细胞TRPV1和TRPV4阳性响应细胞比例和钙离子响应幅度增加,TRPV1通道特异性激动剂刺激肝细胞内的钙离子浓度瞬时剧烈升高,之后迅速衰减并于25秒内恢复静息水平;TRPV4通道特异性激动剂同样刺激肝细胞内的钙离子浓度瞬时剧烈升高,但之后缓慢衰减并于5min内恢复至静息水平。利用MTT法检测细胞的增殖,定量PCR技术检测p21、Bcl-2、Bax、白蛋白(Albumin,ALB)、CYP1A1、CYP1A2、肝细胞核因子1α(Hepatocyte nuclear factor1α,HNF1α)基因的表达,以及蛋白印迹技术检测p-Akt、总Akt蛋白的表达发现,随着培养时间的增加,肝细胞的增殖活力、Bcl-2、ALB、CYP1A1、CYP1A2和HNF1α基因的表达增加,p21和Bax基因的表达先降低后升高,Akt蛋白的磷酸化逐渐减弱。微柱阵列结构基底在培养前期促进了肝细胞的增殖,但在培养后期对肝细胞的增殖促进作用逐渐减弱,在相同微柱直径条件下,较大微柱间距阵列结构基底上肝细胞的增殖高于较小微柱间距阵列结构基底上的肝细胞,在相同微柱间距条件下,较大微柱直径阵列结构基底上肝细胞的增殖高于或趋向于高于较小微柱直径阵列结构基底上的肝细胞。微柱阵列结构基底抑制了肝细胞p21基因和Bax基因的表达,促进了Bcl-2基因的表达,提升了Bcl-2/Bax的比值,但随着培养时间的延长,微柱阵列结构基底对肝细胞p21基因和Bax基因的抑制作用和对Bcl-2基因的促进作用逐渐减弱。微柱阵列结构基底促进了肝细胞白蛋白、细胞色素P450相关基因CYP1A1和CYP1A2、肝细胞转录因子HNF1α的表达,但在培养后期对肝细胞CYP1A2和HNF1α表达的促进作用逐渐减弱。微柱阵列结构基底在培养前期还促进了肝细胞Akt蛋白的磷酸化,但在培养后期对肝细胞Akt蛋白磷酸化的促进作用逐渐减弱直至消失。结果表明微柱阵列结构基底在培养前期通过PI3K/Akt信号通路上调Bcl-2基因表达,下调p21基因和Bax基因表达而促进肝细胞增殖,培养后期不再通过PI3K/Akt信号通路调控肝细胞增殖。微柱阵列结构基底通过PI3K/Akt信号通路上调HNF1α基因表达而促进肝细胞的合成以及解毒功能表型,培养后期不再通过PI3K/Akt信号通路调控肝细胞功能。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R575.3

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