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《重庆大学》 2018年
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力生长因子在膝关节前交叉韧带损伤修复及软骨退变调控中的作用研究

宋阳  
【摘要】:膝关节是人体运动时的主要受力器官,在日常活动和运动中均存在较高的损伤风险。膝关节前交叉韧带(Anterior cruciate ligament,ACL)是连接股骨与胫骨以加强关节稳定性的纤维样弹性结缔组织,其损伤发生率在膝关节损伤病例中占据十分突出的位置。除前交叉韧带自身缺少血管组织外,在其受损后关节腔微环境的变化,尤其是关节滑液的变化,是限制前交叉韧带自我修复能力的主要因素。同时,前交叉韧带损伤导致膝关节力学失稳,极易诱发软骨退变(骨关节炎),而软骨退变引发的反复炎症将进一步扰乱膝关节微环境,这一过程加剧了韧带和软骨的损伤,使膝关节软组织损伤进入一个恶性循环。因此,前交叉韧带损伤及伴随损伤并发的软骨退变在全球范围内受到广泛的关注。目前,临床上运用自体移植、异体移植和假体置换等手段对受损韧带进行重建,并取得一定的效果,但由于重建韧带的功能缺失和术后并发症的影响,限制了患者术后运动能力的完全恢复。因而,采用韧带组织工程结合生物力学,种子细胞,生长因子和生物支架的方法,通过调控受损韧带的生化环境系统,修复失稳的力学环境系统,有望为韧带损伤修复及再生提供新的策略。力生长因子(Mechano growth factor,MGF),作为胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factors,IGF-1)的剪接变异体,在igf-1的C端5号及6号外显子特异性剪接形成的包含24(或25啮齿类动物)个氨基酸的延伸肽段MGF-C24E(MGF-C25E),决定了MGF在生物学功能上存在特异性。MGF-C24E作为一种可注射使用的生长因子,在组织工程研究领域受到广泛关注,尤其在肌骨系统和神经系统的修复再生中表现突出,但我们早期研究发现该生长因子直接作用于ACL进行损伤修复效果并不明显,且缺乏临床可操作性。此外,MGF-C24E在修复受损韧带的同时是否可以避免由于软骨退变造成的力-化学微环境失衡,为韧带损伤提供一个稳定的修复环境将显得尤为重要。基于关节腔微环境是影响ACL损伤修复的关键因素,而滑膜组织及其分泌物直接构成并调节膝关节腔的微环境。所以本研究希望从韧带受损后调节关节腔微环境的角度出发,探索MGF-C24E对损伤韧带的修复作用及分子机理,并通过组织工程手段,结合MGF、滑膜来源干细胞和生物支架,实现ACL的损伤修复和重建。本研究同时探讨了MGF对ACL损伤诱发的软骨退变性疾病骨关节炎(Osteoarthritis,OA)的治疗作用及抗炎机理。本文的主要工作和研究结果如下所述:首先,需明确MGF-C24E对ACL损伤后关节腔微环境的影响是否是积极的。本研究以由于韧带损伤诱发膝关节骨关节炎患者的成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes of osteoarthritis,OA-FLS)为研究对象,通过对OA-FLS进行MGF-C24E体外处理,探讨该生长因子对ACL受损后关节腔微环境调节组织滑膜的影响。研究发现,MGF处理对OA-FLS的活性无显著影响,但可显著抑制其增殖。此外MGF-C24E处理可以显著上调赖氨酸氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)家族成员的基因表达,并激活OA-FLS的内质网应激。同时发现,MGF-C24E处理显著抑制了OA-FLS炎症因子,白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的蛋白表达。以上实验初步证实,MGF-C24E在韧带受损诱发的关节损伤中可以通过调节滑膜细胞的代谢和细胞应激,抑制滑膜细胞的过度增殖、促进关节腔内滑膜细胞的合成代谢,并且具有潜在的降低细胞炎症因子过度表达的作用。这提示我们,MGF-C24E具有调节关节腔微环境,为ACL的损伤修复提供有利条件的潜能。既然MGF-C24E可以为受损韧带提供有利的修复微环境,为进一步探索MGF-C24E是否可以通过调节关节腔微环境,促进ACL的损伤修复,本研究设计了滑膜细胞上清液-韧带细胞共培养系统,以探讨MGF-C24E对ACL的损伤修复作用。实验以正常人成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)和前交叉韧带成纤维细胞(Anterior cruciate ligament fibroblasts,ACLFs)为研究对象,通过对FLS进行力学加载和MGF-C24E共处理,模拟ACL力学损伤过程中MGF-C24E干预治疗紧密包裹在ACL表面的滑膜组织。通过收集以上各实验组的FLS上清液,模拟损伤组和MGF-C24E治疗组关节腔微环境,并与力学加载模拟损伤的ACLFs进行共培养,探讨MGF-C24E通过调节关节腔微环境对ACL损伤的修复作用。研究首先发现,MGF-C24E处理可显著抑制由于力学加载引起的FLS细胞应激和细胞形变,并且通过调控LOX家族基因抑制基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)活性。在滑膜细胞上清液-韧带细胞共培养系统下研究发现,MGF-C24E通过调节滑膜细胞上清液可显著抑制受损ACLFs的MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9表达,同时可显著提高ACLFs的增殖、迁移能力,促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原(Collagen-Ⅲ,Col-Ⅲ)的表达,并恢复由于力学损伤引起的细胞粘弹性变化。以上实验证实,在韧带成纤维细胞模拟损伤过程中,MGF-C24E可以通过调控滑膜成纤维细胞细胞的代谢,调节受损韧带成纤维细胞微环境,进而加速受损ACLFs的增殖、胞外基质合成和力学性质恢复。提示MGF-C24E具有通过调节关节腔生化微环境促进ACL损伤修复的潜能。我们以上研究得知,MGF-C24E可以通过滑膜调控受损ACL的化学微环境促进组织修复,那么在调控化学环境的同时,MGF-C24E是否也可以调动蕴藏在滑膜中的种子细胞,以促进韧带再生呢。基于以往研究,MGF-C24E可有效促进肌肉和跟腱等纤维样软组织的再生以及纤维结构的重塑,本研究进一步探索MGF-C24E诱导滑膜来源干细胞定向分化,是否具有促进韧带再生的潜力。本研究以人膝关节滑膜组织(Synovium)为对象,获取人滑膜来源的间充质干细胞,命名为滑膜间充质干细胞(Synovium mesenchymal stem cells,SMSCs)。其次,对提取的SMSCs进行MGF-C24E诱导处理,检测该细胞向韧带/肌腱,骨,软骨和脂肪分化的标志物基因及蛋白表达,发现MGF-C24E具有诱导SMSCs向韧带分化的潜能。MGF-C24E诱导培养SMSCs 21天后,原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)检测细胞杨氏模量发现,SMSCs细胞模量与ACL成纤维细胞近似。体内实验制造新西兰大白兔膝关节外侧副韧带开窗模型,填充SMSCs/MGF-C24E/Matrigel复合物,建立韧带再生动物模型,术后4周和8周对开窗韧带进行组织学分析。结果显示,SMSCs/MGF-C24E/Matrigel填充组韧带完全愈合,呈现规则的纤维组织排列结构,而无MGF-C24E参与的损伤韧带再生组均未愈合。该研究进证实,MGF-C24E可通过诱导SMSCs向韧带分化,促进韧带再生。最后,为探讨MGF-C24E是否可以加速SMSCs向受损区域迁移,以实现损伤韧带再生,本研究也初探了MGF-C24E对SMSCs迁移能力的影响。研究发现,MGF-C24E通过对FAK-ERK1/2细胞信号通路调控SMSCs迁移能力。综上,本研究提示MGF-C24E可诱导SMSCs向韧带方向分化,并通过FAK-ERK1/2信号通路调控SMSCs细胞迁移,促进受损韧带的再生和重塑。我们知道,韧带损伤造成膝关节系统力学失稳,会导致一系列的膝关节病变,其中骨关节炎(OA)是尤为突出的韧带损伤并发症。而力学失稳,软骨退变和韧带受损之间形成的恶性循环是阻止韧带修复的关键。为研究MGF-C24E是否可以抑制或减缓OA的发生,截停上述恶性循环链,为韧带损伤提供有利的力学微环境便显得尤为重要。本研究以OA患者的关节软骨细胞(Chondrocytes)为研究对象,对其进行12h的MGF-C24E处理。研究结果显示,MGF-C24E可有效抑制OA软骨细胞的自我凋亡现象,并且可以促进该细胞的增殖。同时,研究发现,MGF-C24E促进软骨细胞的迁移,显著提高细胞杨氏模量使其接近正常软骨细胞的力学性质。进一步研究发现,MGF-C24E可促进OA软骨细胞表达正常关节软骨胞外基质相关基因,抑制纤维软骨形成和骨关节炎发生相关基因的表达。蛋白免疫印迹实验发现,MGF-C24E通过调控蛋白质激酶样内质网激酶(Protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)调节内质网应激(Endoplasmic reticulum-stress,ER-stress),进而抑制OA软骨退变。通过对制造的新西兰大白兔膝关节OA模型进行2周关节腔MGF-C24E注射治疗研究发现,与对照组相比,MGF-C24E注射治疗组的关节软骨不会随着OA病程的发生出现关节软骨丢失的现象。本研究提示,MGF-C24E可抑制OA软骨细胞的凋亡,促进细胞增殖、迁移以及胞外基质合成,并通过PERK调控细胞内质网应激,继而抑制OA病程中的软骨退变,为韧带损伤提供有利的力学环境。在新西兰白兔OA模型的MGF-C24E治疗实验中,我们发现MGF-C24E可以有效抑制术后炎症的发生。而以往研究也多次报道MGF-C24E具有抗炎作用。考虑到巨噬细胞在炎症调控中重要作用,本研究进一步探讨了MGF-C24E对巨噬细胞极化作用的影响,以探究MGF-C24E对炎症的调节作用。实验以小鼠来源的巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,对其进行MGF-C25E预处理。结果显示,MGF-C25E可调控巨噬细胞的极化,促使其从M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。为更有效的探究MGF-C25E抗炎作用,避免由于MGF-C25E半衰期短,体内实验不可控等的缺点。本研究通过点击化学手段,制备了丝素蛋白(Silk fibroin,SF)层层自组装的聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)纳米纤维支架,对其表面进行MGF-C25E点击化学修饰,用以研究MGF-C25E的抗炎作用。体外研究结果显示,巨噬细胞培养于MGF-C25E修饰的纳米纤维支架后,M1型巨噬细胞标志物蛋白和基因的表达显著下降,而M2型巨噬细胞标志物蛋白和基因表达显著升高。对2D环境和3D支架环境下,MGF-C25E参与及未参与处理的巨噬细胞进行全基因组测序发现,MGF-C25E通过调控VEGF信号通路、MAPK信号通路、细胞骨架形变相关信号通路以及脂肪酸代谢相关信号通路,实现对巨噬细胞极化行为的调节。同时,在SD大鼠背皮下植入纳米纤维支架的模型研究中发现,MGF-C25E修饰支架组,大鼠背皮炎症反应显著低于对照组(PCL支架,PCL-SF支架)。这些结果表明,MGF-C25E可通过调节巨噬细胞极化行为,诱导该细胞向M2型巨噬细胞转化,进而减轻炎症反应的发生。综上所述,本文较系统性的探讨了MGF-C24E通过滑膜调节韧带损伤后膝关节腔化学微环境,调动关节腔细胞微环境,同时抑制软骨退变,平衡关节腔力学微环境,以实现受损韧带的损伤修复和再生。研究同时探索了其在通过调控巨噬细胞极化实现抗炎功能的作用。本研究的结果拓宽了MGF-C24E在临床治疗和生物医学研究中的应用前景,为实现骨关节系统软组织损伤修复提供了理论依据和研究基础。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R686.5

【参考文献】
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