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《重庆大学》 2018年
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生长因及抗炎因子cocktail协同修复前交叉韧带及其机制的研究

王春莉  
【摘要】:前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)自我愈合能力不足以及有限的临床治疗效果是ACL损伤修复面临的巨大挑战。这需要研究者们深入的探讨ACL难以愈合的原因,并以此为依据寻找到适宜的手段,改善损伤ACL的再生与修复。ACL损伤后,胞外基质合成与降解的平衡与否关系到ACL的修复能力。赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOXs)和基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)参与调节这一平衡过程。由于滑膜组织被认为是ACL损伤后关节腔内微环境的主要调节者,与ACL损伤修复过程密切相关。因此,本文建立滑膜共培养体系,探索ACL无法自我修复的另一影响因素,为ACL的功能性修复提供新的思路和理论依据。并在此修复机理基础上,依据生长因子对LOXs的促进作用,抗炎因子对MMPs的抑制作用,考察了协同生长因子与抗炎因子对ACL成纤维细胞中LOXs与MMPs的调控作用。在体水平进一步验证了协同作用对ACL再生与修复的调控作用。本文的主要研究内容以及相关结果如下:(1)研究人员报道ACL损伤后,滑膜具有膝关节微环境调控作用,为了在细胞水平证实滑膜如何参与微环境调控作用,本文利用共培养体系分析滑膜细胞/上清液对ACL成纤维细胞中LOXs与MMP-1,2,3表达的影响。结果显示滑膜细胞/上清液进一步促进力-化学因素对ACL成纤维细胞中LOXs的减少,对MMP-1,2,3的增加,造成细胞外基质合成与降解的失衡,是ACL无法愈合的重要原因之一。(2)共培养下,力-化学因素介导的MMPs高表达以及LOXs的低表达,造成胞外基快速降解、不利于胞外基质的有序合成,从而阻碍ACL的损伤修复。针对这一问题,本文以LOXs和MMPs为靶向,考察Bay11-7082/EGF修复前交叉韧带。结果显示,单独Bay11-7082作用能够显著抑制力学损伤-炎症因子介导的MMP-1,2,3的高表达。然而,Bay11-7082也抑制了ACLfs中LOXs的表达。这表明Bay11-7082虽然能够通过抑制细胞中降解酶MMPs的表达,减缓胞外基质的降解速度。然而,Bay11-7082对LOXs酶的抑制作用,也减慢胞外基质的合成速度。这提示,单一使用抑制剂修复损伤ACL并不是一个非常理想的治疗手段。同样,单一使用EGF修复ACL也存在缺陷。结果显示,EGF不仅能显著增加正常ACLfs中LOXs的表达,也能在一定程度上恢复力学损伤对LOXs的抑制作用。遗憾的是,EGF也能显著上调ACLfs中MMP-1,2,3的表达。因此,单一使用生长因子修复损伤ACL也不是最佳的治疗方案。既然单一使用生长因子或抗炎因子都不是修复损伤ACL的有效治疗手段。本文考虑协同EGF和Bay11-7082修复损伤ACL。体外细胞水平,Bay11-7082/EGF协同作用不仅显著抑制了力学拉伸对MMP-1,2,3的上调作用,而且恢复了力学拉伸对LOXs的抑制作用。协同Bay11-7082/EGF作用虽不能使LOXs的表达恢复至正常对照组,但损伤ACL成纤维细胞胞外基质合成与降解的不平衡状态得到大大的改善,有利于胞外基质的持续合成与堆积。体内动物水平,Bay11-7082/EGF处理组的ACL具有更好的组织学结构,其形态和胶原含量明显优于对照组。生物力学测试表明,Bay11-7082/EGF处理组的ACL具有更优的力学特性。(3)从组织学评价来看,协同Bay11-7082和EGF修复损伤ACL,能够有效加快损伤ACL组织结构重建。然而,从生物力学性能来看,EGF和Bay11-7082协同作用并不能完全恢复损伤ACL的力学性能。通过查阅文献发现,赖氨酰氧化酶能够催化胞外基质成分发生缩合反应形成供价交叉连接,这种分子间和分子内的交叉连接不仅可以修复破坏的胞外基质,还能增强其机械强度。因此,本章关节腔注射LOX蛋白多肽以增加损伤ACL的力学性能。在实验中,意外发现LOX不仅具有增加组织的力学性能,还能够调控细胞增殖和炎症反应。为了进一步探讨LOX促进细胞增殖、抑制细胞炎症反应的相关机制,通过转录组测序遴选差异表达基因,富集可能存在的信号通路,及可能存在的作用靶点,为进一步LOX的新作用和运用提供研究基础。本文系统性地研究了滑膜微环境对ACL成纤维细胞修复行为的调控作用,证明了滑膜细胞/上清液通过影响力-化学因素调控ACLfs中修复相关基因的表达,并初步证实了滑膜微环境引起的ACL修复行为改变的分子生物学作用。通过协同Bay11-7082和EGF作用双向调控ACLfs中LOXs和MMPs的表达,提高损伤ACL的修复能力。同时,本研究初步揭示了LOX细胞周期、炎症反应等方面的作用,并进一步探索了其在通过增加胶原交联、细胞增殖以及抑制炎症反应实现修复损伤ACL的作用。本研究丰富了促进ACL损伤修复的治疗手段。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R686.5

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