收藏本站
《重庆大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

par1调控斑马鱼淋巴管发育的机制研究

雷道希  
【摘要】:淋巴系统是循环系统的重要组成部分,由淋巴器官、淋巴管及其中的淋巴组成。淋巴管在维持体液平衡、运输免疫细胞、吸收膳食脂肪等生理过程中发挥了重要的作用。淋巴管的发育异常或功能紊乱会导致水肿、肥胖、高血压、炎性疾病与肿瘤转移等。淋巴管的功能如此重要,而当前对淋巴管发育的研究,尤其是对淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells,LEC)命运调控的研究仍处于起步阶段,进一步理解调控淋巴管发育的机制将有助于针对相关靶点开发新的临床治疗手段。我们利用模式生物斑马鱼(zebrafish)和原代人真皮淋巴管内皮细胞(HDLEC),分别从体内和体外两个方面研究了凝血酶受体PAR1/par1及其上下游分子对淋巴管发育的影响,提出了mmp13b/MMP1-par1/PAR1-gnai2a/GNAI2信号通路能通过影响淋巴管内皮细胞(LEC)标记因子prox1a/PROX1的表达而参与调控淋巴管发育过程。体外实验方面,我们主要通过向HDLEC中转染相关基因的siRNA,通过qPCR和Western blot检验其对PROX1的影响。体内实验方面,我们主要通过相关转基因斑马鱼系Tg(fli1:eGFP)和Tg(kdrl:GFP;prox1:RFP),使用 Morpholino 技术和CRIPSR/Cas9技术开展相关基因功能的研究,并结合整胚原位杂交、免疫荧光染色、激光共聚焦成像等检测手段对斑马鱼淋巴管发育情况进行观察与分析。本课题主要的研究内容和结论如下:一、par1/PAR1通过影响LEC标记因子proxla/PROX1参与调控淋巴管发育。我们通过qPCR和WB实验证实,向原代HDLEC中转染PAR1-siRNA能显著抑制PROX1的表达。在斑马鱼胚胎中,整胚原位杂交结果显示斑马鱼的par1于受精后24小时(24 hours post fertilization,24 hpf)在胚胎的后主静脉(PCV)中表达。激光共聚焦成像图片表明,受精后第5天(5 dpf)的斑马鱼par1-morphant和par1-mutant的主要淋巴管——胸导管(TD)均表现出明显的发育不良。我们利用Tg(karl:GFP,prox1:RFP)背景的斑马鱼par1-morphant观察到TD部位红色荧光表达显著下调,该结果与利用Tg(flil:eGFP)背景的斑马鱼par1-mutant中开展的Prox1免疫荧光实验结果相互印证,表明par1是通过影响prox1a的表达而调控淋巴管发育的。二、mmp13b/MMP1 是参与par1/PAR1调控淋巴管发育过程的上游因子。目前已知 PAR1 的上游蛋白酶有 TRY、F2、F10、GZMA、PLG、APC、MMP1、MMP13等,但我们通过qPCR实验发现HDLEC中PAR1的上游配体里仅MMP1显著高表达;且向HDLEC中转染MMP1-siRNA后PROX1的表达受到抑制。斑马鱼中没有mmp1基因,通过生物信息学分析预测斑马鱼mmp13b与人MMP1可能具有相似的功能;我们通过整胚原位杂交实验证实斑马鱼的mmp13b在24 hpf时表达于PCV,与par1的表达的位置一致。通过Par1主要上游配体凝血酶(Thrombin,F2)的Morpholino或抑制剂SCH79797处理后,斑马鱼胚胎的TD发育无明显异常,排除了 F2参与调控淋巴管发育的可能性;但在经过MMP13/MMPs抑制剂处理后,斑马鱼胚胎的TD均表现出与par1功能缺失时相似的异常表型,表明是mmp13b参与了调控斑马鱼淋巴管的发育。三、gnai2a/GNAI2作为下游因子参与了par1/PAR1 调控淋巴管发育的信号通路。PAR1是膜蛋白,主要通过胞内的G蛋白如GNA11、GNAQ、GNA12、GNA13、GNAI1、GNAI2和GNAI3等传递胞外信号;通过qPCR检测发现HDLEC中GNA11、GNA13、GNAI2的表达量相对较高,但在转染PAR1-siRNA 后,仅GNAI2的表达受到抑制;且当转染GNAI2-siRNA后,qPCR和WB的检测结果都表明HDLEC中PROX1的表达量下调。在斑马鱼中,整胚原位杂交实验结果表明gnai2a在24 hpf表达于PCV,与par1和mmp13b的表达位置一致。具有Tg(fli1:eGFP)背景的斑马鱼gnai2a-morphant和gnai2a-mutant在5 dpf时出现显著的TD缺失表型;对具有Tg(karl:GFP;prox1:RFP)背景的斑马鱼 gnai2a-morphant 的观察结果表明其 TD 部位红色荧光表达显著下调,表明是gnai2a通过影响prox1a参与了调控斑马鱼的淋巴管发育过程。综上所述,我们首次发现凝血酶受体Par1能调控斑马鱼淋巴管发育,并提出了 mmp13b/MMP1-par1/PAR1-gnai2a/GNAI2 信号通路是通过影响 LEC 命运决定和维持因子prox1a//PROX1的表达而参与调控淋巴管发育的。本课题中的体外和体内研究结果互相印证,加深了我们对LEC细胞命运调控机制的理解,丰富了我们对斑马鱼淋巴管发育调控机制的认识,也为以PAR1为靶点的临床药物治疗淋巴管相关疾病提供了新的理论基础。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R331.4

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 臧晓霞;纪明山;左平春;陈仕红;孙中华;杜芳;;啶酰菌胺对斑马鱼胚胎及成鱼的毒性[J];农药;2016年12期
2 沈自慧;杨淋清;吴德生;郭昱嵩;袁建辉;周丽;刘建军;庄志雄;;基于斑马鱼胚胎进行化学品毒性评价的方法[J];中国热带医学;2016年12期
3 王鸿奎;巩杰;王新;刘东;;非肌性肌球蛋白Ⅱ-C在斑马鱼胚胎发育过程中的表达[J];交通医学;2016年01期
4 郭樱子;栾亚楠;周玉玲;白承连;任湘鹏;;低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响[J];温州医科大学学报;2016年07期
5 赵崇军;田敬欢;倪媛媛;冯娅茹;代一航;王金凤;樊娇娇;杨冉;马志强;林瑞超;;马钱子对斑马鱼胚胎发育的影响[J];中华中医药学刊;2016年11期
6 刘迎;胡燕;姜蕾;潘波;秦涵淳;林勇;;6种表面活性剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J];生态毒理学报;2014年06期
7 何秋霞;董贞兰;楚杰;孙桂金;韩利文;韩健;刘可春;;芦荟大黄素对斑马鱼胚胎发育及运动行为学的毒性研究[J];山东科学;2015年03期
8 陈怡君;蒲韵竹;颜慧;钟玉绪;王卓;李春杰;查晓丹;赵宝全;刘萍;;冰片对斑马鱼胚胎发育的安全性评价[J];中国药房;2014年19期
9 刘迎;胡燕;姜蕾;潘波;秦涵淳;林勇;;5种酰胺类除草剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J];农药;2014年11期
10 王雪;彭维兵;王希敏;刘可春;陈锡强;张云;;富马酸二甲酯对斑马鱼胚胎早期发育的影响[J];动物学杂志;2013年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 沈自慧;吴德生;郭昱嵩;;基于斑马鱼胚胎进行化学品毒性评价的方法[A];2016年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2016年
2 陈锡强;韩利文;王希敏;王思锋;侯海荣;刘可春;;促渗剂氮酮对斑马鱼胚胎的透皮作用及其毒性影响(英文)[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年
3 张利军;郭家彬;苑晓燕;史慧勤;赵君;束玉磊;彭双清;;应用斑马鱼胚胎和幼鱼评价布洛芬的心脏毒性[A];2013年(第三届)中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年
4 侯佳;桂永浩;张立凤;王跃祥;宋后燕;钟涛;;视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏发育的影响[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编(上册)[C];2008年
5 常成;朱加进;孙启;;瓶装水对斑马鱼胚胎生长发育的影响[A];2017浙江省营养学会年会暨西湖营养学术论坛资料汇编[C];2017年
6 于永利;杨景峰;王思珍;董武;;高残留农药福美双对斑马鱼胚胎体节以及脊索的影响[A];持久性有机污染物论坛2010暨第五届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2010年
7 巴雅斯胡;杨景峰;于永利;王思珍;董武;;高残留农药代森锌诱导斑马鱼胚胎脊索变形[A];持久性有机污染物论坛2011暨第六届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2011年
8 杨维超;苑晓燕;张利军;吴卫东;彭双清;;纳米二氧化硅致斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究[A];2014线粒体毒性与基于毒性通路的安全性评价新策略学术研讨会暨中国毒理学会毒理学替代法与转化毒理学专业委员会成立大会论文集[C];2014年
9 涂文清;徐超;刘维屏;;乙草胺对于斑马鱼胚胎在发育和免疫毒性方面的对映体选择性[A];第四届全国分子手性学术研讨会暨2011绿色手性论坛论文摘要集[C];2011年
10 朱小山;朱琳;李燕;端正花;;富勒烯(C_(60))对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究[A];第三届全国环境化学学术大会论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 实习生 杨阳;斑马鱼可为癌症病人试药[N];科技日报;2017年
2 记者 张梦然;燃煤中发现未知潜在毒副产品[N];科技日报;2017年
3 记者 刘霞;科学家绘出首个脊椎动物发育蓝图[N];科技日报;2008年
4 记者 陈丹;研究发现一些3D打印物品有毒[N];科技日报;2015年
5 记者 毛黎;2008年10大科学突破[N];科技日报;2008年
6 本报驻日内瓦记者 陈建;“中国创新”领跑日内瓦发明展[N];经济日报;2015年
中国博士188bet全文数据库 前10条
1 高蒙;以斑马鱼为模式生物研究HSF4调控晶状体发育和白内障形成的机制[D];华中科技大学;2017年
2 雷道希;par1调控斑马鱼淋巴管发育的机制研究[D];重庆大学;2017年
3 谢华平;利用斑马鱼模型研究Pygo1与fhlA基因的发育生物学功能[D];湖南师范大学;2012年
4 倪睿;Hars非经典功能调控斑马鱼血管发育机制研究[D];西南大学;2018年
5 熊舒婷;miR-200家族在斑马鱼生殖发育中的功能研究[D];华中农业大学;2018年
6 路畅;Dmrt2a和igf2bp1在斑马鱼胚胎发育中的功能研究[D];华中农业大学;2017年
7 邢延奕;斑马鱼dishevelled家族基因调节胚胎图式形成和原肠运动的突变分析[D];山东大学;2018年
8 肖超强;利用斑马鱼探讨氟喹诺酮结构与毒性的关系研究[D];北京协和医学院;2018年
9 施旭来;miR-129-3p在斑马鱼胚胎中的神经保护作用及其机制研究[D];山东大学;2018年
10 黄志斌;c-Myb和C/ebpl在斑马鱼粒细胞发育及疾病形成中的机制研究[D];南方医科大学;2015年
中国硕士188bet全文数据库 前10条
1 张煜;C32基因在斑马鱼牙齿发育中的功能研究[D];南方医科大学;2013年
2 房志兵;斑马鱼内胚层和胆管谱系追踪系统的构建[D];西南大学;2015年
3 张阳萍;斑马鱼血小板特异性转基因系建立和表达分析以及利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除突变体[D];南方医科大学;2016年
4 张雨晴;利用TALEN技术敲除斑马鱼cd99l2基因以及突变体造血表型的初步鉴定[D];南方医科大学;2016年
5 李新阳;EAP1(Enhanced at puberty 1)对雌性斑马鱼青春期发育及生殖能力的影响[D];山东大学;2018年
6 李国清;lrp4在zebrafish胚胎发育中的功能初探[D];西北大学;2018年
7 刘怡;三种PPCPs类药物对293T细胞及斑马鱼的毒理效应研究[D];中国科学院大学(中国科学院重庆绿色智能技术研究院);2018年
8 徐小娜;斑马鱼Per1a对行为节律和核心生物钟基因表达的调节机制[D];苏州大学;2018年
9 吕鹏;异噻唑啉酮类衍生物对斑马鱼胚胎发育的毒理学研究[D];中国农业科学院;2018年
10 袁诗宇;斑马鱼Clock1a蛋白通过polo-like-kinase 1调控其生殖周期[D];苏州大学;2017年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026