收藏本站
《重庆大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

CASP1介导的HO-1 C-端剪切体在自噬和凋亡中作用机制研究

边春象  
【摘要】:背景:皮肤直接与外界接触,易受环境中紫外线UV辐射等产生ROS(reactive oxygen species),引起氧化应激(oxidative stress),炎症,诱发皮肤肿瘤。UV诱导皮肤细胞血红素氧合酶1(heme oxygenase1,HO-1,32kDa)表达,HO-1可降解血红素,具有抗炎,抗凋亡及参与代谢,保护细胞减少氧化损伤等作用。研究发现HO-1可促进肿瘤细胞增殖,抑制化学物质毒性或紫外线照射引发的细胞凋亡,在很多癌组织中HO-1呈高表达,特别在皮肤癌、甲状腺癌和口腔癌等,而且HO-1的高表达与疾病分期和病人预后不良有关。目前,HO-1在肿瘤中的作用是近年来的研究焦点。但最近研究让人们对其作用产生诸多争议。在一些肿瘤中HO-1具有增强细胞耐药性促生长作用,但在前列腺和乳腺癌又具有抑制增殖功能;在对慢性炎症在肥胖和糖尿病作用研究中发现HO-1敲除可抑制代谢炎症和降低胰岛素抗性作用,这与过去认为HO-1的抗炎作用相反。进一步研究发现HO-1可定位于不同细胞器中,如内质网、线粒体和细胞核,而该蛋白的C端存在具有多种剪切方式,可产生不同功能的剪切体(truncated form),如小鼠中发现的28kDa HO-1(C端52氨基酸残基缺失)与Nrf2结合,影响AP-1、NQO1和G6PDH等蛋白活性。因此HO-1不同亚细胞分布和蛋白剪切修饰等导致该蛋白生理功能上差异。那么在人体细胞中HO-1的C端是否存在类似的剪切方式?本研究首次发现UV辐射下caspase 1(CASP1)对人HO-1的C端进行剪切,产生一种新型剪切体,26kDa truncated HO-1(命名为26t HO-1)。本论文将对CASP1对HO-1的剪切方式和26t HO-1入核参与自噬和凋亡调控的机制进行详细的阐述。目的:(1)研究CASP1对HO-1的剪切加工方式a)对26t HO-1的产生方式进行预测;研究HO-1转录后修饰加工与26t HO-1的关系。b)通过对CASP1进行敲除,利用免疫共沉淀、构建HO-1突变体等实验方法,研究CASP1和HO-1之间的相互作用。c)构建A375不同位点的HO-1~(-/-)敲除细胞株,检测HO-1敲除位点的差异对内源性26t HO-1产生的影响。(2)26t HO-1功能研究a)UV辐射引起细胞凋亡与26t HO-1蛋白条带的产生的关系,以及该条带在细胞中的分布。b)研究26t HO-1和细胞自噬和凋亡的关系。c)研究26t HO-1与核转录因子Bmal1作用,及在调控细胞自噬和凋亡的作用。研究方法:通过流式细胞术检测UV辐射对HaCaT细胞凋亡的影响;通过western blot和核质分离研究UV辐射引起26t HO-1的产生及核内的分布;通过构建HA-HO-1和HO-1-HA过表达载体,研究HO-1的C端和N端的剪切方式;通过CRISPR/Cas9系统对CASP1和HO-1进行敲除,构建不同敲除位点的HO-1~(-/-)敲除细胞株;构建HO-1的CASP1识别位点的突变体;免疫荧光检测HO-1、突变体HO-1和26t HO-1在细胞中的分布情况;通过免疫共沉淀检测HO-1与CASP1以及26t HO-1与Bmal1的相互作用;通过构建A375过表达DsRed-LC3B-EGFP的稳定细胞系,检测26t HO-1过表达对细胞自噬的影响;通过RT-RCR检测基因的表达;CCK-8和结晶紫着色检测细胞增殖;肿瘤异种移植模型研究26t HO-1对黑色素瘤增殖的影响;通过免疫组化研究肿瘤组织中Bax的表达。结果:(1)UV辐射下CASP1对HO-1的C端进行剪切,产生26t HO-1,26t HO-1可不依赖UV辐射入核。a)UV辐射可诱导26kDa HO-1的产生,与全长HO-1相比该条带主要在细胞核内分布。UV辐射可诱导全长HO-1入核,而对CASP1敲除可抑制UV辐射下的HO-1的入核现象。b)免疫共沉淀实验证实HO-1与CASP1的相互作用,HO-1的CASP1识别位点的突变体抑制26kDa HO-1的产生。HO-1的不同位点敲除构建的A375HO-1~(-/-)细胞株具有不同的细胞形态和生物学特性,并影响内源性26t HO-1的产生。(2)26t HO-1具有促自噬和凋亡作用,证实26t HO-1在核内与转录因子Bmal1结合,调控基因表达。a)与全长HO-1相比,26t HO-1在促细胞自噬方面的效应更强。26t HO-1过表达可显著上调自噬相关基因Beclin-1、LC3B、Atg3、Atg5、Atg7和Atg14的表达(RNA和蛋白水平)。b)与全长HO-1相比,26t HO-1可显著影响细胞凋亡。26t HO-1过表达促剪切型caspase3和9的产生,在裸鼠成瘤实验中抑制肿瘤的生长,并上调凋亡分子Bax的表达。c)与野生型A375细胞相比,保留CASP1识别位点的A375 HO-1敲除细胞株HO-1~(-/-)1#中可检测到26t HO-1,而未保留CASP1识别位点的A375 HO-1敲除细胞株HO-1~(-/-)2#中未可检测到26t HO-1。与A375 HO-1~(-/-)2#相比,A375 HO-1~(-/-)1#细胞增殖能力显著降低,自噬相关基因的表达显著升高,同时在该细胞中检测到剪切型caspase 9产生。d)通过免疫共沉淀实验发现26t HO-1与核转录因子Bmal1的相互作用,同时发现与HO-1相比,26t HO-1可促Bmal1入核。对Bmal1的干扰可抑制26t HO-1引起的自噬和凋亡相关分子的表达。结论:UV辐射引起细胞凋亡,同时导致26t HO-1的产生,该蛋白的产生和UV激活的CASP1有关。CASP1与HO-1结合,对HO-1的C端进行剪切产生的26t HO-1入核,与核转录因子Bmal1结合,调控细胞自噬和凋亡。目前关于HO-1的研究多聚焦在32kDa HO-1上,但这些研究在阐明HO-1参与基因调控的功能和解释HO-1功能的多样性方面显得不足,该研究提供了一个全新的角度来研究HO-1,为研究HO-1在UV辐射在肿瘤的中作用奠定基础,同时为皮肤肿瘤和其他光损伤性皮肤疾病提供一定的临床应用证据。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R329.2

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张静晓;刘晓洁;杨春;陈盼盼;张丽雷;;几种天然产物与CASP3靶点的相互作用机制探索[J];世界科学技术-中医药现代化;2017年11期
2 ;CASP8 promoter polymorphism,mRNA expression and risk of prostate cancer among Chinese men[J];Journal of Biomedical Research;2011年02期
3 ;Association of CASP9,CASP10 gene polymorphisms and tea drinking with colorectal cancer risk in the Han Chinese population[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2013年01期
4 李思;张阳德;刘蔚东;;Observation of Effectiveness of Clinical Sterilization by CASP-80A Low-Temperature Plasma Sterilizer[J];Plasma Science and Technology;2006年05期
5 段成钢;张怡;;语项的加工投入、结构特征、使用频率和交际效果——基于CASP模型的二语习得研究介绍[J];外国语言文学;2017年01期
6 Songyu Cao;Cheng Wang;Xinen Huang;Juncheng Dai;Lingmin Hu;Yao Liu;Jiaping Chen;Hongxia Ma;Guangfu Jin;Zhibin Hu;Lin Xu;Hongbing Shen;;Prognostic assessment of apoptotic gene polymorphisms in non-small cell lung cancer in Chinese[J];The Journal of Biomedical Research;2013年03期
7 戴长文,戴晓弘;离子极化和高氯酸盐热稳定性规律的CASP标度[J];高等学校化学学报;1992年05期
8 李菲卡;李明珠;陶婷;李嫣然;杜萱;;无创中心动脉压正常范围的初步探讨[J];诊断学理论与实践;2010年02期
9 LV Qiang;WU HongJie;WU JinZhen;HUANG Xu;LUO XiaoHu;QIAN PeiDe;;A parallel ant colonies approach to de novo prediction of protein backbone in CASP8/9[J];Science China(Information Sciences);2013年10期
10 Yu-xi WANG;Si-ran ZHANG;Xue XU;Cheng-tan LI;Wei ZHENG;Jian-bo ZHAO;Yan-fang WANG;Li-hui ZHANG;;Involvement of cysteinyl leukotriene signaling in microglial morphological changes and CASP1 expression in vitro[J];中国药理学与毒理学杂志;2017年10期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 Hui Zhang;Ye Zhao;Qiang Xu;Yuejin Hua;;Structural insights into the activity of DraN, a β-CASP family nuclease from Deinococcus radiodurans[A];第四届中国结构生物学学术讨论会论文摘要集[C];2013年
2 谭云飞;朱俊鹏;仇雅菊;廖峥娈;于恩彦;;老年人生活质量问卷(CASP-19)适用性的初步研究[A];2013浙江省医学会精神病学分会学术年会暨浙江省医师协会精神科医师分会第六届年会论文汇编[C];2013年
3 谭云飞;朱俊鹏;仇雅菊;廖峥娈;于恩彦;;老年人生活质量问卷(CASP-19)适用性的初步研究[A];2013年浙江省医学会精神病学分会老年精神障碍学组学术会议论文汇编[C];2013年
4 吴爱平;田丽青;胡云;曹洋;苗智超;蒋太交;;蛋白质结构预测平台TJ_Jiang及其在CASP8中的表现[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年
5 ;A six-nucleotide insertion-deletion polymorphism in the CASP8 promoter is associated with susceptibility to multiple cancers[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2007年
6 马小菊;张雪;梁博萱;刘学星;彭靖;郭虹雨;邓娜;张钊瑞;廖其龙;邓棋霏;肖勇梅;;彗星自动化分析软件Opencomet的应用研究[A];2018环境与健康学术会议--精准环境健康:跨学科合作的挑战论文汇编[C];2018年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 王雪飞;一些基因变异者不易得癌症[N];健康报;2007年
2 主任医师 罗荣喜;一些基因变异者不易得癌症[N];大众卫生报;2007年
3 神经内科专家 匡培根;不可过分依赖高科技诊断[N];中国高新技术产业导报;2001年
中国博士188bet全文数据库 前10条
1 边春象;CASP1介导的HO-1 C-端剪切体在自噬和凋亡中作用机制研究[D];重庆大学;2018年
2 刘晓真;神经管畸形患者携带的CASP9基因错义突变对蛋白功能及细胞凋亡的影响[D];北京协和医学院;2017年
3 钱吉;CASP家族基因变异与晚期非小细胞肺癌含铂化疗的关联研究[D];复旦大学;2012年
4 黄健清;EGFR/KRAS/ALK野生型NSCLC中凋亡通路变化及顺铂联用PAC-1体外抗肿瘤的实验研究[D];南方医科大学;2011年
5 单敬轩;人类激酶RIOK3的功能研究[D];复旦大学;2007年
6 徐林艳;肿瘤细胞凋亡过程中TNFRSF10B和CFLAR调控机制研究[D];山东大学;2015年
7 刘娟;狂犬病病毒磷蛋白调控细胞自噬的分子机制研究[D];浙江大学;2016年
8 周舜泰;中国北方汉族人群FAS(-1377G→A和-670A→G)、FASL(-844C→T)及CASP8(-652 6N ins→del)基因多态性与HBV感染不同结局的关联研究[D];中国协和医科大学;2008年
9 吕铮;CASP8、Fas和FasL基因多态与外周T细胞淋巴瘤易感性及临床特点和预后的相关性研究[D];中国协和医科大学;2010年
10 顾少华;细胞凋亡相关基因单核苷酸多态与铂类治疗晚期非小细胞肺癌[D];复旦大学;2010年
中国硕士188bet全文数据库 前10条
1 吴洁;高血压患者中心动脉压相关因素的分析[D];遵义医学院;2018年
2 王伟;CAPN1基因和CASP9基因在牛骨骼肌形成中的功能作用研究[D];河南科技大学;2017年
3 张雷;血管内皮钙黏蛋白的表达与CASP脓毒症大鼠肠系膜微循环的关系[D];首都医科大学;2016年
4 梁红玲;CASP3/PARP1等凋亡分子在肺癌中的表达分析及其促凋亡实验研究[D];广州医学院;2012年
5 陈伟;CASP3基因多态性与川崎病及冠脉损害的相关研究[D];天津医科大学;2013年
6 刘晶霞;MTHFR基因、CASP8基因遗传多态性与急性淋巴细胞白血病[D];第三军医大学;2008年
7 张博;CASP8、microRNA相关基因多态性与恶性淋巴瘤易感性及预后关系研究[D];第三军医大学;2013年
8 孙力;肺癌耐药与恶性胸腔积液治疗的研究[D];吉林大学;2009年
9 阿荣;白沙蒿种子多糖的结构及活性研究[D];内蒙古大学;2004年
10 王黎;高血压患者动脉硬化与中心动脉压及颈动脉内膜厚度的关系[D];新疆医科大学;2015年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026