保藏本站
《四川农业大学》 2014年
保藏 | 手机翻开

减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研讨

黄凌远  
【摘要】:罗非鱼是我国重要的淡水饲养鱼类。近年来,罗非鱼无乳链球菌病的爆发给罗非鱼饲养业形成了巨大的丢掉。本课题,以2009年,在海南爆发的罗非鱼无乳链球菌病为布景展开了针对该病的口服核酸疫苗的研讨。咱们将编码Sip蛋白的sip基因克隆至真核表达载体pVAX1,构建了重组质粒pVAX1-sip,并将该重组质粒电转化到减毒沙门氏菌SL7207,成功构建了以减毒沙门氏菌为载体的口服核酸疫苗。点评了疫苗的安全性、安稳性、在罗非鱼的安排散布以及口服免疫作用。具体内容包含:1.罗非鱼无乳链球菌sip基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达以罗非鱼源无乳链球菌的强毒力株(JF423941)的DNA为模板,PCR扩增了sip基因,并T-克隆,质粒测序剖析,sip基因长度为1002bp,编码333个氨基酸(KJ398146.1)。在T-克隆重组质粒的根底上,以pVAX1为载体,成功构建了真核表达重组质粒。经过脂质体转染,重组质粒成功转染EPC细胞,使用直接免疫荧光法和蛋白免疫印迹法,证明晰Sip蛋白在EPC细胞内的表达和表达蛋白免疫原性。2.重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性判定本章选用电转化技能,成功将核酸疫苗质粒导入了减毒沙门氏菌SL7207。对构建的重组减毒沙门氏菌进行了生物学特性剖析,成果标明将外源基因导入减毒沙门氏菌载体菌株后,重组减毒沙门氏菌的成长特性未发作明显改变,与原始株趋于共同。在体外,在含抗生素培育环境下SL7207-pVAX1和SL7207-pVAX1-sip两株重组菌的质粒比较安稳,传代50代后,质粒安稳性依然在90%以上;在不含抗生素培育环境下,重组沙门氏菌中的质粒安稳性有所下降,跟着传代数的增加,或许存在质粒的丢掉,但在35代内,安稳性依然可以在80%以上,显现了较好的安稳性。体内安稳性试验标明减毒沙门氏菌可以安稳带着外源基因有用侵染到罗非鱼的各安排器官,为核酸疫苗发挥作用供给了条件确保,一起重组菌在免疫接种后28d,可以彻底从机体消除,也标明晰该重组菌具有较好的生物安全性。本章还调查了烘干和贮存温度对口服免疫饲猜中重组菌的影响,成果提示低温烘干和低温贮存可以下降重组菌的丢掉率,一起主张口服免疫饲料尽量现配现用,以确保最佳免疫作用。3.核酸疫苗的安全性研讨本章将不同浓度的重组菌核酸疫苗SL7207-PVAX1-sip灌胃接种罗非鱼,计算逝世率,得该重组菌对罗非鱼的半数致死量(LD50)为1.7×1011cfu/尾,该LD50值极高,标明对罗非鱼的毒力极弱。以灌胃途径免疫接种,在不高于1.25×1010cfu/尾灌服剂量范围内,罗非鱼不会呈现逝世等反常症状,相对安全。以109cfu/mL,0.5mL/尾,灌胃接种罗非鱼,整个试验期间罗非鱼未发作逝世等反常,安排病理学调查标明,对照组和免疫组的各个安排脏器均相对正常,该剂量下免疫接种不会对罗非鱼形成病理损害,是安全的。基因整合试验标明,在检测敏感度为102拷贝数下,重组质粒不会与罗非鱼发作染色体整合。综上,经过重组菌毒力试验,重组菌对罗非鱼的病理损害点评和外源基因与宿主基因整合性三方面调查,均证明该疫苗对罗非鱼是安全的。4.核酸质粒在罗非鱼体内的安排散布及阳性表达本章对核酸质粒和表达的Sip蛋白进行了安排散布调查,成果标明,经过PCR检测,证明核酸质粒可散布于罗非鱼的肠道、肝脏、脾脏和肾脏;使用免疫组化办法,检测到表达的蛋白可散布于脾脏和肝脏。核酸质粒或表达的蛋白在安排内存留的时刻与免疫接种次数呈正相关。试验成果标明,减毒沙门氏菌可以作为核酸疫苗的运载体,将sip基因带着并转移到靶安排,一起核酸疫苗质粒可以在罗非鱼体内进行有用的表达,为后期免疫试验奠定了根底。5.重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫作用调查罗非鱼经灌胃和投喂免疫饲料两种途径,分不同免疫次数进行免疫接种。调查了免疫后罗非鱼的血清总蛋白含量、血清总超氧化物歧化酶SOD含量、血清溶菌酶活性、血清补体C3含量、血清抗菌活性这些非特异性免疫目标以及体液免疫目标抗体效价和细胞免疫目标IL-1β、TNF-α细胞因子转录水平。归纳评价了本课题研讨的核酸疫苗对罗非鱼的免疫作用。成果标明,灌胃和投喂免疫饲料两种免疫方法,均可以有用的诱导免疫应对反响。使罗非鱼获得抗无乳链球菌感染的才能。灌胃组最高免疫保护率为57%,拌料组最高免疫保护率可达63%。根据前期的安全性研讨成果,终究引荐免疫程序为:108cfu/g拌料免疫接种,进行三个免疫程序,每次距离7d,每次接连口服7d,每次每尾按鱼体重1%投喂免疫饲料。
【学位颁发单位】:四川农业大学
【学位等级】:博士
【学位颁发年份】:2014
【分类号】:S943

【参考文献】
我国硕士188bet全文数据库 前2条
1 常雪莲;猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因密码子优化真核载体的构建及其在体内、外表达的试验研讨[D];安徽医科大学;2010年
2 秦学远;TGEV S基因减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗株的开始构建[D];四川农业大学;2008年
【共引文献】
我国硕士188bet全文数据库 前2条
1 刘立营;根据全基因组成技能的南极假丝酵母脂肪酶B基因的密码子优化研讨[D];华中科技大学;2011年
2 曾瑜虹;禽传染性支气管炎病毒N基因减毒沙门氏菌疫苗构建及免疫原性研讨[D];四川农业大学;2009年
【类似文献】
我国期刊全文数据库 前10条
1 李永富,陶健,高敏行;罗非鱼饲养技能之三:使用鳗池饲养彩虹鲷试验[J];我国水产;2002年05期
2 余伟明;罗非鱼的养分与饲料[J];科学养鱼;2002年04期
3 袁建新;西北地区罗非鱼饲养试验[J];科学养鱼;2002年06期
4 ;罗非鱼饲养与出口获得严重进展[J];渔业现代化;2003年05期
5 力文荐;广西罗非鱼“抢滩”国外“游”上外国人的餐桌[J];渔业致富攻略;2003年18期
6 ;罗非鱼收买声急 养成质量左右商场[J];渔业致富攻略;2003年22期
7 劳卫晓;罗非鱼饲养新形式[J];我国水产;2004年06期
8 张海明;罗非鱼的饲养及其开展前景[J];饲料广角;2004年11期
9 古乃广,罗永贵;罗非鱼饲养技能之一 大水面主养罗非鱼技能关键[J];我国水产;2004年09期
10 张清佳;无公害罗非鱼饲养的四大问题与对策[J];渔业致富攻略;2004年15期
我国重要会议论文全文数据库 前10条
1 袁永明;张红燕;贺艳辉;王红卫;;罗非鱼出产饲养种类挑选决议计划要素剖析[A];2009’我国渔业经济专家论坛论文摘要集[C];2009年
2 赵永锋;林连升;;寒潮对南边罗非鱼饲养的影响及应对办法[A];我国科学技能协会2008防灾减灾论坛论文集[C];2008年
3 贺艳辉;袁永明;张红燕;龚贇翀;王红卫;;高效生态罗非鱼饲养形式讨论[A];渔业科技立异与开展方法改变——2011年我国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
4 郑宗林;汪开毓;Delbert M.Gatlin III c;;百泰A~对罗非鱼成长功能、氮磷分泌和抗病机能的影响[A];2009年我国水产学会学术年会论文摘要集[C];2009年
5 李智丽;陈红;曾振灵;;罗非鱼链球菌的药敏试验及多西环素的药动学[A];我国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十次研讨会论文摘要集[C];2009年
6 李彦;刘利平;赵广学;胡振雄;苏晓明;;罗非鱼饲养水体中增加碳源对水质及成长的影响[A];渔业科技立异与开展方法改变——2011年我国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
7 蒙子宁;吴丰;杨丽萍;林浩然;;我国罗非鱼7个引入种的线粒体基因序列变异及亲缘联系剖析[A];第二届我国动物学会比较内分泌学分会和发育生物学分会联合学术研讨会论文集[C];2005年
8 吴宗文;刘志全;张健;高启平;高廷富;罗华;张雨熙;陈齐勇;吴小平;;水库网箱浮性饲料饲养罗非鱼高效饲养形式[A];我国南边十六省(市、区)水产学会渔业学术论坛第二十六次学术交流大会论文集(上册)[C];2010年
9 吴宗文;张健;高廷富;罗华;吴小平;张雨熙;陈齐勇;;水库网箱浮性饲料饲养罗非鱼高效饲养形式[A];第二届全国现代生态渔业可继续开展论文集[C];2010年
10 吴宗文;吴小平;李杰;;水库网箱浮性饲料饲养罗非鱼生态高效饲养形式[A];第三届全国现代生态渔业办理与技能研讨[C];2011年
我国重要报纸全文数据库 前10条
1 杨春虹;海南罗非鱼出口问题多 昌盛背面有隐忧[N];我国交易报;2007年
2 全国水产技能推广总站 王玉堂;罗非鱼产业化之路负重致远[N];我国渔业报;2006年
3 ;海南将扩展罗非鱼饲养[N];我国渔业报;2007年
4 谭耿瑞;茂名养出让全球顾客定心的罗非鱼[N];我国渔业报;2007年
5 冒日;茂名罗非鱼收买价格渐趋安稳[N];我国渔业报;2007年
6 庹朝均孙岁寒;广东罗非鱼商场继续低迷[N];我国渔业报;2007年
7 杨青生;罗非鱼深加工技能获得严重成功[N];广西日报;2007年
8 记者 吴棉 特约记者 郑善;文昌兴起全省最大罗非鱼饲养基地[N];海南日报;2006年
9 记者 侯小健;海南罗非鱼总产量居全国第二[N];海南日报;2006年
10 杨春虹;罗非鱼昌盛背面有隐忧[N];海南日报;2007年
我国博士188bet全文数据库 前3条
1 黄凌远;减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研讨[D];四川农业大学;2014年
2 范武江;萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)及其杂交子孙耐盐相关基因的研讨[D];上海海洋大学;2011年
3 胡彩虹;纳米载铜硅酸盐对水产病原菌的吸附、灭菌活性及其在罗非鱼上的使用作用与机理研讨[D];浙江大学;2005年
我国硕士188bet全文数据库 前10条
1 颜明月;臭氧水处理对罗非鱼片蛋白质和脂质氧化及质量的影响[D];广西大学;2015年
2 周梦海;我国罗非鱼不同饲养形式的异味物质含量散布[D];上海海洋大学;2015年
3 韩金林;不同加工饲料的理化特性及其对罗非鱼成长功能的影响[D];武汉轻工大学;2015年
4 李鹏;罗非鱼鱼鳞明胶的高值化使用[D];海南大学;2014年
5 陆艳;广东省罗非鱼饲养技能功率及其影响要素研讨[D];南京农业大学;2014年
6 瞿叶辉;罗非鱼副产物酶解工艺优化及壳聚糖埃洛石微球固定化木瓜蛋白酶的研讨[D];广东工业大学;2016年
7 王赛;水质、藻类改变对罗非鱼异味发生的影响及异味去除开始讨论[D];广东海洋大学;2012年
8 李金花;罗非鱼与鲮鱼对水质影响的试验研讨[D];暨南大学;2007年
9 郑俊彦;我国罗非鱼外贸产业链利益和谐机制研讨[D];江南大学;2012年
10 于爱清;“新吉富”罗非鱼选育后期代代成长和遗传变异剖析[D];上海海洋大学;2011年
 方便付款方法  订货知网充值卡  订货热线  协助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026