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《西南大学》 2012年
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黄颡鱼IgM分子及其表达研讨

李春涛  
【摘要】:黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)是我国重要的淡水饲养鱼类,对其免疫系统的研讨不仅在黄颡鱼及其它鱼类病害防治方面具有重要价值,并且在脊椎动物比较免疫及免疫发作方面也具有重要意义。本论文对编码黄颡鱼免疫球蛋白(Ig)M重链(H)和轻链(L)基因cDNA进行了克隆,并研讨了IgM的表达规则及其传递和个别发作 运用RT和RACE PCR办法扩增出黄颡鱼IgM重链(ycIgM)和免疫球蛋白轻链(ycIgL) L1、L2和L3全长cDNA。 yclgM cDNA全长为1993bp,包括5'非编码区42bp,3'非编码区229bp,开放阅读框1722bp,编码573个氨基酸。ycIgL1cDNA全长为1021bp,包括5’非编码区39bp,3'非编码区259bp,开放阅读框723bp,编码240个氨基酸。ycIg L2cDNA全长为953bp,包括5'非编码区57bp,3'非编码区164bp,开放阅读框732bp,编码243个氨基酸。ycIg L3cDNA全长为965bp,包括5'非编码区58bp,3'非编码区184bp,开放阅读框723bp,编码240个氨基酸。序列比对剖析标明ycIgM、ycIgL1ycIgL2和ycIgL3基因与斑驳叉尾鯝的类似性最高为52.3%、90.%、80.2%和68.9%,并在进化树中别离与斑驳叉尾鯝的IgM、IgL-G、IgL-2和IgL-F聚为一支。 RT-PCR标明yclgM基因首要在头肾、中肾、脾脏和血液中表达,而在心脏、肌肉和脑中表达量很少。ycIg L1基因首要在头肾、脾脏、鳃、肠和血液表达,在肌肉、皮肤和脑中表达量很少;L2基因首要在头肾、脾脏、鳃、肠和血液表达,在心脏和脑中表达量很少;L3基因首要在脾脏、鳃、肠、肝和血液中表达,而在心脏和脑中表达量很少。 Real-time PCR剖析标明,打针嗜水气单胞菌后,ycIgM基因在黄颡鱼头肾、脾脏、肝和血液表达量在15d有明显上升,而在肠安排中5d内明显添加,15d康复到影响前水平。原位杂交剖析标明,ycIgM基因阳性细胞呈现在头肾、脾脏、鳃和肠安排中,打针嗜水气单胞菌15d后,头肾和脾脏安排中阳性细胞明显添加。而此刻肝脏安排中也开端检测到了ycIgM基因阳性细胞。 经过原核表达载体pQE30,使用IPTG诱导,在大肠杆菌表达菌株M15取得很多可溶ycIgM蛋白。以纯化后的重组ycIgM蛋白为抗原,免疫新西兰兔制备了抗ycIgM蛋白的多克隆抗血清,ELISA测定抗血清效价约为1:512000; Western blot剖析显现IgM在健康黄颡鱼头肾、脾脏、血清、皮肤、鳃、肠、肝和中肾中表达;免疫组化剖析标明,ycIgM蛋白阳性信号呈现在头肾、脾脏、鳃、肠和肝脏安排中,打针嗜水气单胞菌15d后,在这些安排中阳性信号有不同程度的改变。免疫荧光剖析标明丰厚的ycIgM蛋白荧光信号呈现在头肾、脾脏、鳃、肠和肝脏安排中。 使用RT-PCR和Real-time PCR技能,在黄颡鱼卵和胚胎中检测到ycIgM mRNA。胚胎孵化后14d时仔鱼匀浆中检测到ycIgM mRNA,而在3-7d内没有检测到。使用Elisa技能,在黄颡鱼卵、胚胎、仔鱼各时刻点都检测到yclgM蛋白,并且逐步下降,在孵化9d蛋白表达量最低,到14d蛋白表达开端上升。这些研讨标明,ycIgM mRNA和蛋白在仔鱼前期没有组成,存在于前期仔鱼的ycIgM蛋白来自于亲体。
【学位颁发单位】:西南大学
【学位等级】:博士
【学位颁发年份】:2012
【分类号】:S917.4

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