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《西北农林科技大学》 2017年
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禾谷镰刀菌候选G蛋白偶联受体基因和AMD1基因的功能研究

曹淑琳  
【摘要】:禾谷镰刀菌是世界很多地区小粒谷物作物和玉米的重要病原菌。不仅造成严重的产量和经济损失,侵染的谷物还会被其产生的毒素污染对人畜健康造成很大的威胁。G蛋白偶联受体(GPCRs),膜受体蛋白,识别和介导不同的细胞外环境信号做出迅速的反应,在调控真菌生长、发育、营养识别、交配、侵染和毒性过程中起到重要的桥梁作用。可能的GPCRs已经在镰刀菌基因组比较中预测出来,而禾谷镰刀菌中GPCRs的系统分析还没有被报道。首先,我们获得了85个GPCRs基因敲除突变体并且对所有突变体的生长、产孢、有性生殖、侵染进行了分析。3个GPCRs基因缺失突变体对小麦的侵染能力降低,另外三个3个GPCRs基因(PRE1、CRL1、CRL2)分别调控子囊壳的大小、子囊壳的形成、子囊的发育。可能是由于GPCRs基因功能的冗余,所有敲除突变体菌丝生长正常并且不影响产孢量。对crl1和crl2的进一步研究发现CRL1的缺失不影响菌丝融合,与mat1-1-1杂交,作为父本时可育,伤口或小麦茎节可以诱导crl1子囊壳前体的产生,而且表达CRL1的ORF区不能互补突变体子囊壳产生的缺陷,而crl1突变体中表达包括CRL1及其3’UTR区可以产生正常的子囊壳并发育正常的子囊孢子。crl2突变体可以产生正常的子囊壳,但子囊的发育存在严重缺陷,有性诱导8 d后观察发现没有完整的子囊发育出来,核荧光结果显示发育缺陷的子囊内有且仅有1个细胞核,因此CRL2基因的敲除使得有性生殖停留在了产囊丝钩阶段。RNA-seq结果显示CRL1在有性诱导1 d后已经开始表达,逐渐升高,到第4 d时表达量最高,与其表型表现出来的子囊壳产生受阻一致;不同的是,CRL2在有性诱导3 d后开始表达,并随着有性发育的推进表达量一直升高,因此相比于crl1阻止有性诱导前期发育,crl2则使得有性发育停止在了中后期子囊的发育,而且Crl2-GFP定位信号开始于有性诱导后4 d的子囊膜上也吻合了Crl2在有性时期功能的调控阶段在有性诱导4 d子囊开始发育的时间。外源cAMP不能恢复突变体crl1和crl2的表型,crl1,crl2突变体中PDE2基因的敲除(既增加细胞内cAMP的水平)也不能互补突变体的表型,说明CRL1、CRL2介导的信号传递过程对有性生殖的调控不依赖于细胞内保守的cAMP-PKA信号通路。禾谷镰刀菌的子囊孢子作为小麦赤霉病的初侵染源,当温度湿度适宜附着在小麦穗部萌发侵染开始。前面关于GPCRs基因CRL1、CRL2分别在有性发育前期和中期调控有性生殖,而转录组数据表明同样编码跨膜蛋白的基因AMD1在有性发育后期特异表达,我们的研究结果也说明AMD1基因的缺失影响子囊后期的成熟及子囊孢子的释放。而且不影响无性生长和产孢量这与AMD1在有性生殖后期特异的表达一致。有性诱导8 d或更长的时间子囊壳压开发现子囊孢子散乱的堆积在一起,而子囊孢子形态正常。与Fgkin1和gea1突变体类似,amd1突变体子囊壳内散乱的子囊孢子会在一端萌发,定量结果也表明Fgkin1突变体中AMD1的表达量下调5倍多。Liu等在禾谷镰刀发现RNA编辑并且特异的发生在有性时期,AMD1基因是其中一个ORF区有一个提前终止密码子被编辑的基因,被编辑之后才能编码完整的蛋白。AMD1编码一个有MFS(major facilitator superfamily)结构域和11 TM(transmembrane helixes)结构域的蛋白。本研究中,我们进一步研究了AMD1基因的功能及UAG到UGG编辑发生的作用。amd1突变体中表达基因组上的AMD1基因(我们称之为野生型AMD1)和编辑过的AMD1形式可以互补突变体在子囊孢子释放和子囊孢子萌发的缺陷。而没有被编辑的形式表型缺陷与突变体相似。过表达也可以互补突变体的缺陷。RP27启动子过表达AMD1对禾谷镰刀菌的生长及无性发育没有什么影响。另外,Amd1-GFP融合表达发现Amd1定位在子囊膜上,而且Amd1仅在子囊果形成的真菌中出现。有趣的是,AMD1的缺失造成一些与转运蛋白或膜相关蛋白表达亮上调。总之,这些结果表明Amd1定位在子囊膜上对维持子囊壁的完整性至关重要,而且AMD1转录形式的A-to-I RAN编辑对于子囊孢子的喷发及子囊孢子萌发自我抑制是十分重要的。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S432.44

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