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《西北农林科技大学》 2017年
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激动素对谷氨酸诱导的HT22细胞氧化损伤干预作用及相关机制研究

魏云鹏  
【摘要】:背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种严重危害老年人身心健康和生活质量的神经退行性疾病。越来越多的证据表明,氧化应激很可能在AD发病和发展过程中发挥着极其重要的作用。激动素是腺嘌呤的甲基呋喃衍生物,研究表明其能够在动物个体、组织和细胞水平上发挥显著的抗氧化应激和抗衰老作用。HT22细胞是来源于小鼠海马神经元的永生化细胞系,谷氨酸能诱导其发生氧化应激和细胞死亡,因此它是研究神经元氧化损伤的良好细胞模型。本研究探索了激动素对谷氨酸诱导的HT22细胞氧化损伤的保护作用,对抗AD药物的筛选具有重要意义。目的:研究激动素对谷氨酸诱导的HT22细胞氧化损伤的保护作用及其相关机制。方法:首先,通过DPPH清除试验、三价铁还原试验、羟自由基抑制试验、超氧阴离子抑制试验和二价铁离子螯合试验,对激动素体外抗氧化能力予以评估,同时通过CCK8细胞活力试验对激动素的安全浓度范围和最佳处理时间进行了筛选。然后,通过CCK8细胞活力试验和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)细胞毒性试验研究了激动素对谷氨酸处理的HT22细胞活力下降及LDH泄露的影响;通过流式细胞术研究了激动素对细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和Ca~(2+)水平的影响;通过相关试剂盒研究了激动素对细胞内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平、抗氧化酶活性和细胞抗氧化能力的影响;通过流式细胞术评估了激动素对细胞凋亡的影响;通过ATP试剂盒检测细胞内ATP含量,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)以及Western Blot(WB)方法检测凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor,AIF)核转移,评估了激动素对线粒体功能的影响;通过WB方法研究了激动素对谷氨酸处理的HT22细胞中凋亡信号调节激-1(Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK-1)、c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和丝裂原激活蛋白激酶p38(Mitogen activated protein kinase p38,p38)活化的影响。最后,通过WB、实时定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)研究了激动素对Nrf2核转移和血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)表达影响,通过siRNA沉默和CCK8细胞活力试验研究了Nrf2和HO-1对激动素细胞保护作用的影响。结果:(1)和阳性对照相比,激动素自身几乎没有抗氧化能力;(2)激动素的安全浓度范围在5mg/L之下,最佳预处理时间为8h;(3)激动素能够抑制谷氨酸诱导的HT22细胞活力下降和LDH泄露增加;(4)激动素能够抑制细胞内ROS和Ca~(2+)水平上升,提高细胞内抗氧化酶的活性和GSH水平,增强细胞抗氧化能力;(5)相对于谷氨酸处理组,激动素能部分恢复细胞内ATP水平,抑制MMP的去极化和AIF的核转移,同时能够抑制谷氨酸诱导的HT22细胞凋亡;(6)激动素能够抑制谷氨酸诱导的ASK-1、JNK和p38的磷酸化;(7)激动素能够显著促进Nrf2的核转移,且具有时间依赖性;能够显著促进Nrf2下游基因HO-1在转录和翻译水平上的表达,且呈现出时间和剂量依赖性。此外,使用Nrf2 siRNA靶向沉默Nrf2几乎完全消除了激动素的细胞保护作用,而使用HO-1siRNA靶向沉默HO-1只能部分消除激动素的细胞保护作用。结论:激动素自身基本不具备抗氧化能力,但其能够抑制谷氨酸诱导的HT22细胞毒性,抑制细胞内ROS聚集和Ca~(2+)水平升高,抑制细胞内抗氧化酶活性的下降,且激动素自身对细胞抗氧化酶系统具有活化作用。同时,激动素能够抑制线粒体功能障碍和细胞凋亡,抑制谷氨酸诱导的HT22细胞中ASK-1、JNK和p38的活化。此外,激动素能够激活Nrf2信号通路,并能增强其下游抗氧化基因HO-1的表达,而且激动素细胞保护作用的发挥依赖Nrf2的活化和HO-1的表达。这些结果表明激动素具有神经保护作用,可能在预防和治疗AD的研究和实践中具有应用潜力。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R749.16

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