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《西北农林科技大学》 2017年
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Rab1A和Rab5对猪瘟病毒增殖的影响及机制

林吉辉  
【摘要】:猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的传染病,其典型症状与病理特征为高热以及全身组织弥散性出血。CSF分布于很多国家和地区,曾经给全世界养猪业造成重大经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)规定为必须报告的动物传染病,我国将其列为一类动物疫病。CSFV是单股正链、有囊膜的RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)。病毒作为严格的细胞内寄生生物,由于其基因组的局限性,病毒基因复制、病毒颗粒组装与释放等过程通常需要在宿主细胞因子的帮助下才能完成。因此,探究细胞因子对猪瘟病毒复制增殖的作用机制,对于揭示猪瘟病毒的致病机理有重要意义。真核细胞内含有多种由脂质和蛋白组成的膜性细胞器,胞内物质在膜性细胞器之间的运输由囊泡运输系统调节。Rab蛋白属于Ras小GTPase超家族,是一大类在细胞膜运输中发挥调控功能的蛋白,也是Ras超家族中参与囊泡运输的最大亚家族。囊膜病毒通常依赖细胞的膜泡运输指导其结构蛋白和基因组到达病毒的复制、组装以及出芽位点。Rab蛋白已经被证实参与多种重要致病性病毒的复制增殖过程。为了探究Rab蛋白家族中Rab1A与Rab5对CSFV复制增殖的影响及机制,我们开展了研究工作,获得了以下结果:(1)Rab1A对CSFV增殖的影响。将针对Rab1A的3条shRNA序列分别插入慢病毒干扰载体中,并用包装出的重组慢病毒感染PK-15细胞,得到3株Rab1A干扰的PK-15细胞系(PK-Rab1A-sh1、2、3)。分析各细胞系中Rab1A的mRNA与蛋白水平,筛选出Rab1A表达干扰效率最高的PK-Rab1A-sh2细胞,该细胞接种CSFV后,病毒NS2基因拷贝数与E2蛋白水平明显低于对照细胞。表明敲降宿主Rab1A后,CSFV增殖受到明显抑制。再者,抑制Rab1A控制的内质网到高尔基体的运输途径,同样能明显抑制CSFV增殖。说明Rab1A与其控制的内质网到高尔基体的物质运输在CSFV复制过程中有非常重要的作用。(2)Rab1A促进CSFV粒子的组装。用RT-qPCR分析病毒基因拷贝数,间接免疫荧光检测病毒滴度,结果表明CSFV在PK-Rab1A-sh2细胞中的第一个增殖周期内,细胞内病毒基因拷贝数与对照细胞内病毒基因拷贝数没有明显差异,而细胞外上清中病毒滴度明显低于对照细胞外上清中病毒滴度,表明Rab1A敲降不影响病毒基因组复制,而抑制了病毒粒子的组装或释放。进一步分析CSFV第一个增殖周期内细胞内病毒滴度与E2蛋白表达量,结果显示Rab1A敲降不影响细胞内病毒E2蛋白表达水平,而使细胞内病毒滴度明显下降,表明Rab1A作用于病毒颗粒的组装产生感染性病毒粒子,不影响病毒粒子释放。在细胞培养中,用中和抗体阻断CSFV的扩散,消除了Rab1A对病毒多周期复制的抑制作用,反向证明敲降Rab1A抑制了CSFV病毒颗粒的组装。再者,免疫共沉淀试验证明Rab1A与病毒NS5A相结合,激光共聚焦显微镜观察证明Rab1A与NS5A在细胞内存在共定位现象,说明Rab1A与病毒NS5A协同作用于CSFV颗粒组装过程。(3)Rab5对CSFV增殖的影响。用重组慢病毒感染的方法建立了Rab5过表达的PK-15细胞系(PK-LV-Rab5)、Rab5干扰的PK-15细胞系(PK-Rab5-sh1、2、3)。RT-qPCR和Western blot分析表明,PK-LV-Rab5中Rab5的表达量显著高于对照细胞;而干扰细胞系中PK-Rab5-sh1拥有最高的Rab5敲降效率。分析CSFV在过表达的PK-LV-Rab5细胞与敲降Rab5表达的PK-Rab5-sh1细胞中的增殖情况表明,与对照细胞相比,过表达Rab5能明显提高CSFVNS2基因与E2蛋白水平,而敲降Rab5降低CSFVNS2基因与E2蛋白水平。说明过表达Rab5促进CSFV增殖,敲降Rab5抑制CSFV增殖。再者,真核表达载体介导的Rab5过表达同样能促进CSFV增殖,进一步表明Rab5蛋白在CSFV增殖过程中扮演重要角色。(4)Rab5与CSFV NS4B相互作用并促进NS4B相关复合物的形成。Co-IP与GST-pulldown证明Rab5与CSFV复制酶蛋白之一的NS4B相互作用,激光共聚焦显微镜亦观察到二者在细胞内的共定位现象。NS4B-Red在CSFV感染的细胞内表达后,以点状形式分布于细胞质内。当细胞内Rab5功能被其显性负突变体Rab5S34N抑制后,点状NS4B-Red消失不见,转而变为网状形式均匀分布于细胞质中。分析NS4B表达水平发现NS4B表达水平没有下降,提示抑制Rab5功能可造成NS4B诱导的复合物解散,即Rab5能促进NS4B相关复合物的形成。再者,激光共聚焦显微镜观察到NS4B与CSFV复制酶NS3、NS5A共定位于点状NS4B复合物上,说明NS4B诱导的复合物可能是病毒的复制复合物。综上所述,本研究表明GTPase家族中的Rab1A和Rab5蛋白在CSFV复制增殖过程中具有重要的正调控作用;Rab1A与病毒NS5A蛋白结合并作用于病毒粒子组装,以产生感染性病毒颗粒;Rab5与NS4B相互作用以促进NS4B诱导复合物的形成,进而促进CSFV增殖。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651

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