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《西北农林科技大学》 2017年
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猪伪狂犬病毒变异株感染细胞的差异蛋白质组分析及高温传代致弱疫苗的研究

梁超  
【摘要】:伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染所致的一种急性传染病。猪是PRV的主要贮存宿主,PRV可以导致仔猪高死亡率以及母猪繁殖障碍,给养猪业造成了极大的经济损失。PRV侵染宿主细胞的过程十分复杂,目前关于PRV的致病机制等问题尚未完全清楚,这为深入研究及寻找PR新型治疗、预防靶标带来了诸多困难。目前疫苗接种仍是防控PR最重要的手段,但是自2011年底以来,我国多省份免疫猪群爆发了由致病力增强的PRV变异毒株引发的疫情,传统PRV疫苗Bartha-K61已不能给猪群提供完全保护,这使我国PR的防控面临着更为严峻的挑战。基于以上背景,本研究利用PRV流行变异毒株JS-2012感染PK-15细胞,对细胞感染PRV后蛋白质表达变化情况以及差异表达蛋白的功能等特性进行分析,获得PRV感染细胞后蛋白质水平上的关于细胞反应的整体认识,为揭示PRV的致病机制奠定基础;同时,为了能迅速采取有效措施应对目前PRV变异毒株的蔓延流行,对PRV JS-2012进行连续高温(40℃)传代,获得PRV gE缺失变异弱毒株作为标记疫苗候选株,进行动物安全性实验和免疫保护力评价,用以防控猪场PRV变异株的流行。本研究的主要内容和结果如下:1.将PRV JS-2012感染PK-15细胞,分别于感染后2 h、4 h及7 h这3个时间点收集细胞样本,利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术结合液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)技术,对细胞蛋白质表达变化情况进行鉴定与分析,分别筛选到71个、198个及122个差异表达蛋白。不同时间点的差异表达蛋白在生物学功能及参与通路等方面存在差异。2 h时的差异表达蛋白主要与细胞内蛋白转运、转录正调控、蛋白磷酸化以及信号转导等相关;4 h时差异表达蛋白主要与转录、信号转导、免疫反应以及凋亡等相关;7 h时差异表达蛋白除上述一些功能外,还有一些蛋白参与囊泡运输、多细胞体生成、控制肌动蛋白丝空间分布、蛋白在质膜定位及免疫应答等。该结果也在一定程度上显示出细胞蛋白质的变化动态与PRV复制过程所处的不同阶段(侵入、转录及表达、组装及释放等过程)相对应的关系。进一步从全部差异表达蛋白中筛选出与免疫相关的蛋白进行STRING分析,发现蛋白SRC占据网络中心位置,与多个蛋白存在潜在相互作用关系。本研究对PRV感染细胞后的细胞蛋白质组进行定量分析,为揭示PRV的致病机制奠定了基础。2.对PRV JS-2012在Vero细胞中进行连续高温(40℃)传120代,对第120代病毒进行空斑纯化后成功获得了一株gE缺失变异弱毒株JS-2012-F120。通过基因序列分析发现JS-2012-F120基因组从US8(gE)第487位至US2第531位发生了一段2307 bp的缺失,间接免疫荧光实验证实了JS-2012-F120无法表达gE蛋白。JS-2012-F120在细胞上的生长特性与亲本毒株JS-2012存在显著差异。JS-2012-F120比JS-2012在细胞上增殖更快,且毒价明显高于亲本毒JS-2012,高达10~(9.25) TCID_(50)/ml。JS-2012-F120的蚀斑形态及CPE也与JS-2012明显不同,JS-2012-F120在细胞感染整个过程中未观察到PRV的典型CPE现象,即合胞体形成。3.为确定不同代次的传代病毒对仔猪的安全性,以10~6 TCID_(50)/每头份的剂量分别对十四日龄仔猪滴鼻接种PRV第5代、50代、91代及120代传代病毒即PRV JS-2012-P5H、JS-2012-P50H、JS-2012-P91H及JS-2012-P120H(JS-2012-F120),持续观察3周。接种JS-2012-P5H组5头实验猪全部出现严重的PR临床症状及高烧,5天内全部死亡;接种JS-2012-P50H组出现较轻微的PR临床症状及发热,2头死亡;接种JS-2012-P91H组3头猪出现一过性发热,1头猪持续发热7天且精神沉郁,另有1头猪未见临床症状,5头猪全部存活;接种JS-2012-F120组5头实验猪均未见任何临床症状,体温一直保持正常。对所有存活的实验猪(攻毒后21天剖杀)及病死猪进行剖检发现,接种JS-2012-P5H组、JS-2012-P50H组及JS-2012-P91H组病死猪及出现PR症状后存活的猪可见不同程度的脑膜充血、肺脏出血、脾脏坏死及出血点、淋巴结水肿等病理变化;而接种JS-2012-P91H组中一头无临床症状的实验猪及接种JS-2012-P120H组全部实验猪脏器均无明显的病理变化。这表明,随着病毒传代次数增高,病毒毒力不断下降,PRV JS-2012-F120对两周龄仔猪已不具有致病性,对仔猪安全。4.为了评估PRV JS-2012-F120对PRV经典强毒株及变异流行强毒株的免疫保护力,以10~(5 )TCID_(50)/每头份的免疫剂量对两组14日龄仔猪进行免疫接种,并设置两组接种DMEM的对照组。于免疫后每天采血检测抗体,免疫JS-2012-F120的两组实验猪血清中均检测到gB抗体,gE抗体始终均呈阴性。免疫28天后分别对两组免疫组及两组对照组接种PRV经典强毒株SC及变异流行毒株JS-2012。免疫JS-2012-F120的两组实验猪在攻SC或者JS-2012强毒后均未见任何临床症状;接种DMEM的两组在攻毒后全部出现发热及PR临床症状,攻JS-2012组全部死亡,攻SC组死亡4头。攻毒后,免疫了JS-2012-F120的两组实验猪血清gE抗体始终呈阴性。综上所述,以PRV JS-2012-F120接种仔猪,能有效抵抗变异强毒株和经典强毒株的攻击,对仔猪提供完全保护;同时血清不能产生gE抗体。JS-2012-F120可以作为一株标记疫苗候选株用以防控猪场变异PRV的流行。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651

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