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《西北农林科技大学》 2017年
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PGC7互作蛋白的鉴定及功能研究

刘红亮  
【摘要】:PGC7(Primordial germ cell 7)是一个早期胚胎发育所必需的母源效应因子,其在生殖细胞,卵母细胞,植入前胚胎和多能性细胞中特异表达。目前,大量研究表明PGC7在印记维持,转录抑制,染色质凝缩,细胞分裂和细胞多能性维持等生物学过程中发挥重要作用。但其参与这些生物学过程的分子机理仍不清楚。本研究通过生物信息学分析发现PGC7是一个固有无序蛋白(Intrinsically disordered protein),且不具备已知的酶结构域,其功能的发挥依赖于它的互作蛋白。因此,本研究从PGC7相互作用蛋白的鉴定入手分析了PGC7及其互作蛋白的功能。主要研究内容和结果如下:1.PGC7蛋白的功能无序分析。本研究利用一组无序预测工具分析了PGC7蛋白的无序倾向和结构特点。发现PGC7蛋白是一个高度无序的蛋白(无序氨基酸残基含量大于30%)。2.利用链霉亲和素-生物素亲和纯化技术鉴定了PGC7在HEK293T细胞中的相互作用蛋白。本研究准备了两组细胞样品:一组同时表达BirA酶和带生物素标签的PGC7蛋白;另一组仅表达BirA酶作为对照。在证明PGC7可以被生物素化修饰后,比较了未修饰的PGC7和生物素化修饰的PGC7的细胞内分布。结果证明未修饰的PGC7和生物素化修饰的PGC7蛋白在HEK293T细胞中的分布无差异。随后利用链霉亲和素-生物素亲和纯化技术分离获得PGC7蛋白复合物,质谱鉴定出291个PGC7互作蛋白,其中290个为本研究新发现的PGC7互作蛋白。生物信息学分析发现PGC7的互作蛋白与核苷酸结合,RNA结合,结构分子活性和核糖体结构组成等分子功能密切相关。KEGG通路分析显示PGC7的互作蛋白与核糖体和卵细胞减数分裂通路密切相关。3.蛋白质相互作用网络分析。本研究利用STRING数据库和Cytoscape v3.4.0软件构建了PGC7互作蛋白的相互作用网络。进一步使用“MCODE”插件程序分析得到14个关系密切的子网络。这些子网络的功能涉及转录,RNA加工,蛋白质运输和细胞周期调控等。4.根据生物信息学分析的结果,本研究选择了28个PGC7的互作蛋白并设计构建了这些蛋白的真核表达载体。免疫共沉淀实验证明了PGC7与其中23个蛋白的相互作用,包括UHRF1,MAGED2,KPNB1,GNB2L1,FBL,STAT1,CDK2,HNRNPR,YBX1,HSPA2,CDK5,AKAP8L,PPP2R1A,NOP2,MCM6,RPL14,YWHAG,U2AF2,HP1BP3,DMAP1,NUPL1,KPNA1和RBBP4。5.PGC7与HP1BP3互作的分析。本研究设计构建了2个PGC7截短突变体和3个HP1BP3截短突变体的真核表达载体。免疫共沉淀分析发现PGC7利用其C末端(76-150aa)与HP1BP3的球状结构域(158-412 aa)互作。进一步的研究发现过表达PGC7抑制HP1BP3与HP1蛋白的结合。6.PGC7与HP1BP3协同调控印记基因的表达及甲基化。本研究成功建立了Hp1bp3基因敲除的F9细胞系。定量PCR检测发现HP1BP3敲除显著下调了印记基因H19,Rasgrf1,Gtl2和Peg1的表达,上调了印记基因Peg10的表达。在Hp1bp3基因敲除的F9细胞中,过表达HP1BP3可以恢复印记基因Gtl2,H19,Rasgrf1和Peg10的表达至正常水平,过表达PGC7可以显著上调印记基因Gtl2的表达。亚硫酸盐测序分析发现HP1BP3敲除显著上调了印记基因Gtl2启动子区的DNA甲基化水平。在Hp1bp3基因敲除的F9细胞中过表达HP1BP3或PGC7可以下调印记基因Gtl2启动子区的DNA甲基化水平。进一步的ChIP-qPCR分析证明PGC7和HP1BP3协同拮抗DNMT3A,进而调控印记基因Gtl2启动子区的甲基化。7.DMAP1蛋白的功能研究。根据预测的蛋白折叠信息,本研究设计构建了3个DMAP1截短突变体的真核表达载体。免疫共沉淀分析发现PGC7利用其C末端(76-150aa)与DMAP1的Coiled-coil结构域(235-412 aa)互作。进一步的研究发现DMAP1可以调控DNMT1与PGC7的互作。此外,本研究建立了Dmap1单等位基因敲除的F9细胞系。免疫染色分析显示DMAP1敲降不影响F9细胞的整体DNA甲基化水平。定量PCR检测显示DMAP1敲降显著下调了印记基因H19和Peg1的表达,显著上调印记基因Peg10的表达。但亚硫酸盐测序分析证明DMAP1敲降不影响印记基因Peg1,Peg10,H19和Rasgrf1印记调控区的DNA甲基化水平。综上所述,本研究鉴定出大量PGC7互作蛋白,这极大的丰富了PGC7的互作蛋白质组。此外,本研究还深入研究了PGC7与HP1BP3,PGC7与DMAP1的互作及功能。这些都为进一步阐明PGC7在各种生物学过程中的分子机理提供了重要依据。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q51

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