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《西北农林科技大学》 2017年
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黄瓜花叶病毒2b蛋白亚细胞定位以及与RPSS11蛋白互作对其功能的影响

王瑞临  
【摘要】:黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)是雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属的典型成员,分为IA、IB和II三个亚族,是分布最广、最具经济重要性的模式植物病毒之一。由CMV基因组RNA2转录出的亚基因组RNA4A翻译而来的2b蛋白是一种多功能蛋白,在病毒的致病过程中扮演着致病因子、病毒移动决定因子和基因沉默抑制子的角色。CMV2b蛋白通过其编码的核定位信号可引导蛋白质进入细胞核,本论文探讨除了细胞核定位以外在胞质内的亚细胞定位。通过将GFP-Fny2b融合蛋白与质体、线粒体、高尔基体、内质网、过氧化物酶体等细胞器以及微管、微丝等细胞骨架的标记蛋白共定位,利用共聚焦显微镜观察融合的荧光信号。结果显示2b蛋白的亚细胞分布定位于微管。经过Oryzalin处理,2b蛋白依然能够定位在二聚体蛋白解聚合的微管,从侧面证实了Fny2b定位于微管。为了研究CMV2b蛋白细胞核定位信号序列区别与细胞核定位能力差异之间的相关性,对黄瓜花叶病毒中的不同株系的2b蛋白基因进行扩增,构建重组pBI-GFP-GUS-2b表达载体,并且在大肠杆菌进行扩繁鉴定。最后将成功构建好的分别带有8个株系2b基因的表达载体转化农杆菌并浸润注射模式植物本氏烟,得到不同株系中2b蛋白核定位情况。利用共聚焦显微镜观察到的荧光信号将各株系2b蛋白的细胞核定位能力直观展现,并且将细胞核荧光量化,挑选出核定位能力最强的PGs株系,并且验证了PGs株系核定位序列的核定位能力。为了研究模式植物病毒CMV与宿主互作的机理,以LS2b蛋白作为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选出拟南芥cDNA文库与LS2b蛋白互作的宿主蛋白。通过拟南芥文库筛选测序,获得了12种阳性克隆的互作蛋白,我们选择核糖体蛋白亚基11(RPS11)重点进行进一步研究。将筛选出互作的蛋白经过酵母双杂交验证后,设计引物从反转录的拟南芥cDNA中扩增出RPS5、RPS11、2bBP19蛋白的全长基因,克隆到酵母表达载体,共转化后进行全长互作蛋白的酵母双杂交验证。酵母双杂交系统验证了蛋白互作之后进行pulldown实验验证筛选蛋白与LS2b病毒蛋白的体外互作能力。利用原核表达载体表达带有His标签的RPS11、RPS5蛋白以及GST、GST-LS2b融合蛋白,再利用His标签亲和镍柱纯化His-RPS5及His-RPS11蛋白,用GST亲和柱纯化GST及GST-LS2b蛋白。将纯化后的蛋白进行GST-pulldown实验,通过GST亲和柱对GST-LS2b的吸附以及互作代表的吸附作用,结果中检测到LS2b与RPS11、RPS5互作的条带,验证了LS2b与RPS11、RPS5体外互作的能力。利用双分子荧光互补(BiFC)的方法检测CMVLS2b蛋白与RPS11宿主内源蛋白在植物体内发生相互作用。首先通过常规的分子克隆方法分别将LS2b和NbRPS11序列克隆到BIFC表达载体并测序鉴定,之后再转化农杆菌,农杆菌介导的瞬时表达方法在本氏烟中瞬时表达YFP片段融合的LS2b和RPS11蛋白,利用激光共聚焦显微镜观察荧光信号,荧光观察结果显示,无论将LS2b和NbRPS11蛋白融合在YFP的N端还是C端,都有因为LS2b与RPS11蛋白互作产生的黄色荧光信号,而其它阴性对照组均未观察到黄色荧光,这说明NbRPS11蛋白与CMV2b蛋白在本氏烟植物细胞内发生互作。植物病毒介导的基因沉默技术是目前研究植物基因功能及植物病毒侵染宿主机理分析等方面应用最广泛的一种技术。本实验中,利用TRV介导的基因沉默技术下调宿主本氏烟中RPS11的mRNA水平,分析RPS11在CMV侵染复制积累过程中以及2b蛋白沉默抑制过程中的作用。含有TRV-RPS11的农杆菌接种本氏烟7天后,系统叶RPS11的mRNA水平通过半定量反转录PCR的验证,证实了TRV介导的基因沉默技术下调宿主本氏烟中RPS11的效果。将CMV病毒基因组侵染性RNA1、RNA2和用GFP替代CP的RNA3农杆菌混和浸润接种于RPS11下调的本氏烟叶片,经过Northern blot杂交分析,与对照组相比,RPS11下调组CMV病毒基因组复制低于对照组。Western blot杂交分析GFP积累量来反映CMV病毒基因组复制得到同样结果,而用于对照的PVX-GFP则没有收到RPS11下调的影响。直接在RPS11下调的本氏烟叶片上摩擦侵染CMV病毒粒子,经过Northern blot杂交分析系统叶病毒含量,RPS11下调组系统叶CMV病毒粒子积累也低于对照组,而用于对照的ToMV则没有受到RPS11下调的影响。实验结果说明宿主内源蛋白RPS11对CMV侵染及病毒积累产生了影响,RPS11下调使CMV侵染性基因组复制降低,也使CMV病毒粒子侵染积累减弱。利用35S启动子表达的GFP及沉默抑制子,分析RPS11在CMVLS2b沉默抑制作用的影响。在RPS11下调的本氏烟叶片上分别同时浸润接种GFP及各种沉默抑制子,Western blot杂交分析GFP表达量。结果表明相比对照,只有LS2b抑制子受到RPS11下调的影响,沉默抑制作用减弱,宿主防御增强使GFP积累降低。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S432.41

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