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《西北农林科技大学》 2017年
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拟南芥var2花斑突变体增强修饰基因的克隆和功能研究

王瑞娟  
【摘要】:在真核光合生物中,叶绿体不仅是进行光合作用的场所,同时还在信号转导过程中发挥不可或缺的作用。叶绿体的正常发育是植物正常生长和发育的前提。叶绿体的发生和发育受到许多生物过程的调控。拟南芥突变体var2因缺少金属蛋白酶FtsH2而具有独特的叶片花斑表型,花斑的程度受到发育和环境因素的调节,是研究叶绿体发育调控的理想模型。通过遗传筛选var2的修饰突变基因能够更好的理解VAR2的功能和叶绿体发育的调控。这些修饰突变包括花斑逆转突变和花斑增强突变,分别命名为(?)UPPRESSOR OF (?)A(?)IEGATION(SVR)和(?)NHANCER OF (?)A(?)IEGATION(EVR)。本研究以var2-5叶片花斑增强为出发点,鉴定了两个var2的花斑增强修饰基因EVR1和EVR2。通过对EVR1和EVR2在叶片花斑形成过程中的作用展开研究,为VAR2在叶绿体发育的调控中的功能提供有见解性的信息。本研究的结果如下:(1)从激活标签突变体库中筛选到了两个能增强var2-5叶片花斑的突变体evr1-1和evr2-1。evr1-1具有正常的叶色和发育延迟和莲座叶顶端变尖的表型;evr2-1具有淡绿的叶片表型。遗传分析表明这两个突变体也能增强var2-4的叶片花斑。(2)通过TAIL-PCR方法,克隆了EVR1/At3g53890。半定量RT-PCR检测,在evr1-1单突变体和098-004(evr1-1 var2-5)双突变体中At3g53890的表达量降低。分别在evr1-1和098-004背景中过表达At3g53890基因组DNA能使单突变体回复到野生型表型,双突变体回复到var2的叶片表型。证明EVR1就是At3g53890,在花斑增强突变株098-004以及evr1-1中,EVR1表达的降低导致了叶片花斑程度的增强和单突变体的发育表型。(3)EVR1编码细胞质核糖体小亚基蛋白RPS21B。编码核糖体蛋白的基因以基因家族的形式存在,拟南芥RPS21家族含有两个有功能的成员RPS21B和RPS21C。序列对比分析表明EVR1和EVR1L1/RPS21C的氨基酸序列有高度的同源性。通过EVR1和EVR1L1融合绿色荧光蛋白的瞬时表达发现,RPS21B和RPS21C定位在细胞质和细胞核。(4)半定量RT-PCR和组织化学染色分析结果显示EVR1和EVR1L1基因在各种组织中都有表达,尤其在分生组织中的表达量更高。(5)EVR1L1基因的突变体evr1l1-1与evr1-1类似,也具有发育延迟和真叶顶端变尖的表型,但是evr1l1-1的发育表型弱于evr1-1。evr1l1-1也能增强var2-5或var2-4的花斑,与单突变体表型的强弱程度一致的是,evr1l1-1对var2花斑的增强能力没有evr1-1强。在evr1l1-1背景下过表达EVR1L1能使突变体回复到野生型。(6)EVR1和EVR1L1的功能是冗余的。遗传分析表明,evr1-1和evr1l1-1之间是非等位非互补的遗传关系,植物至少需要两个拷贝的RPS21基因才能存活。在evr1-1和花斑增强突变体098-004中过表达EVR1L1能挽救突变体的表型。在evr1l1-1和花斑增强突变体evr1l1-1 var2-5中过表达EVR1能使突变体的表型回复。此外,在evr1-1和花斑增强突变株098-004中过表达由表皮特异的启动子驱动的EVR1和EVR1L1都能使突变体的表型回复。(7)半定量RT-PCR结果显示,组成FtsH复合体的四种FtsH基因的表达量在evr1-1和098-004突变体中没有发生改变。杂交结果显示,在花斑增强突变株098-004中,FtsH2/8和其它核基因编码的叶绿体蛋白含量没有明显的变化,而叶绿体基因组编码的蛋白含量降低。(8)EVR1和EVR1L1调控许多和生长素相关的发育表型。evr1-1和evr1l1-1在发育的早期表现出典型的表型,例如真叶尖和发育延迟、子叶叶脉异常、根和下胚轴变短。(9)具有发育延迟表型的核糖体蛋白突变体都能增强var2的叶片花斑。40S和60S亚基核糖体蛋白突变体对var2花斑增强的效果是不同的,核糖体小亚基蛋白突变体对var2花斑的增强效应比核糖体大亚基蛋白突变体的强,而且核糖体小亚基蛋白突变体的表型的强弱与对var2花斑增强的效果呈正相关。蛋白质翻译抑制剂cycloheximide对var2的花斑没有增强作用。表明40S小亚基在VAR2介导的叶绿体的发育中起更重要的作用。(10)遗传分析发现,evr1-1对var1-1和thf1-2的叶片花斑都有较弱的增强效应。(11)evr1-1不能改变具有叶绿体翻译缺陷的var2花斑逆转突变体svr8、svr9和prpl11-1的叶色表型。但是当evr1-1、逆转突变体与var2-5或var2-4结合时,三突变体的叶片花斑表型与这些叶绿体发育突变体表型的强弱相关,叶绿体发育突变体的表型越强,三突变体的花斑程度越低。表明核糖体蛋白突变体对var2叶片花斑的增强依赖于叶绿体的翻译。(12)通过图位克隆的方法,克隆了EVR2/At2g35260。序列分析表明在evr2-1中由于T-DNA的插入造成了EVR2基因的删除。半定量RT-PCR分析表明在突变体中因为EVR2基因的缺失而检测不到EVR2的转录产物。分别在evr2-1单突变体和085-004双突变体中过表达At2g35260的基因组DNA能使单突变体回复到野生型表型,双突变体回复到var2的叶片表型,证明在evr2-1和085-004中,EVR2的缺失导致了单突变体出现淡绿表型,双突变体叶片花斑程度的增强。(13)将EVR2的开放阅读框融合绿色荧光蛋白进行瞬时表达发现,这个蛋白定位在叶绿体。通过半定量RT-PCR和组织化学染色分析结果显示,除了种子和花瓣,EVR2在其它的各种组织中都有表达。(14)evr2-1能显著增强var1-1的花斑,但对thf1-2的叶片花斑没有影响。综上所述,细胞质核糖体40S亚基对在VAR2介导的叶绿体的发育途径中起重要作用。而且细胞质翻译和叶绿体翻译的平衡调控var2的花斑表型。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2

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