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《中国农业科学院》 2017年
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水稻早衰突变体es7和pls5基因的图位克隆与功能研究

毕真真  
【摘要】:本研究从实验室的突变体库中,筛选得到两个早衰突变体,分别命名为es7和pls5。随后分别对其开展了表型分析、基因定位与克隆、基因功能分析等相关工作,获得的主要结果如下:1.通过~(60)Co辐射诱变93-11种子,筛选得到一个水稻早衰突变体es7。在大田种植条件下,播种60天左右时,下部叶片开始出现衰老,随着植株的生长发育,衰老越来越严重。在高浓度二氧化碳条件下,光呼吸被抑制,es7表型可以得到恢复。生理指标检测分析发现,es7突变体中,有大量H_2O_2积累,并且过氧化氢酶活性显著降低,植株总抗氧化能力降低;同时衰老相关基因表达量都显著升高。图位克隆和测序分析发现,在88kb范围内,第9个ORF(LOC_Os07g46460)的第二个外显子和内含子衔接处(1292bp),有一个碱基发生了突变,由G突变为A,导致mRNA缺失57个碱基,最终导致蛋白保守的purF-type谷氨酰胺转移区域结构异常。ES7基因编码一个铁氧还原蛋白依赖的谷氨酸合酶(Fd-GOGAT),是一个组成型表达的基因,并且其编码的蛋白定位于叶绿体。荧光定量PCR分析显示,在es7突变体中,很多氮代谢相关的基因表达量和酶活性都发生了改变,大部分游离氨基酸含量也显著降低;并且叶绿素合成相关基因表达量也都显著降低。另外,当幼苗生长在浓度逐渐增加的NH_4~+条件下,叶绿素的含量依然显著低于野生型。我们的研究结果表明,Fd-GOGAT突变导致es7的早衰表型,该基因参与氮代谢,影响叶绿素的合成,并且可能参与光呼吸过程,最终影响叶片衰老。2.通过EMS诱变中恢8015(ZH8015)种子,筛选得到一个早衰突变体pls5。在播种60天左右,从pls5突变体下部叶片叶尖开始,出现黄化衰老干枯。随着植株的生长发育,衰老叶片的数量、衰老的程度都逐渐增加。到抽穗期时,衰老程度已经很严重,除剑叶叶片,其他叶片的中上部都已经明显的衰老干枯。到灌浆期,几乎整个植株都已经衰老干枯。pls5突变体叶绿素含量显著降低,光合作用降低,农艺相关性状受到影响,使单株产量显著降低。DAB、依文思蓝染色、TUNEL实验以及生理指标检测显示,pls5突变体中有过量H_2O_2积累,过氧化物酶活性降低,细胞死亡增加。叶片透射电镜观察显示,pls5突变体叶绿体结构异常,叶绿体降解加速。遗传分析表明,pls5早衰表型是由一个核隐性单基因控制。利用图位克隆的方法,将该基因定位于5号染色体69.3kb范围内,包含12个开放阅读框。经测序分析发现,在第七个开放阅读框LOC_Os05g48060内,在633-643位置缺失11个碱基,最终导致蛋白翻译提前终止。该基因编码一个磷脂酰丝氨酸合酶,即Os PSS2(SUI2)。转基因遗传互补、RNAi等表明,pls5突变体的表型是由OsPSS2突变引起的。进化分析显示,该基因在不同的物种中同源性和保守性都很高。PLS5在水稻中组成型表达,并且在没有衰老的叶片中表达量较高;PLS5蛋白定位于细胞膜和核膜。叶绿素合成、降解以及光合作用相关基因表达量分析显示,pls5突变体叶绿素合成受阻,叶绿体降解加速。同时,离体和体内高温处理实验说明,pls5突变体对高温更敏感,高温环境加速其衰老。以上结果说明:pls5早衰表型是由OsPSS2突变引起的。PLS5突变可加速水稻衰老,促进细胞死亡,降低水稻对高温的耐受性;并且间接影响水稻产量。以上结果为进一步研究该基因在水稻叶片衰老中的作用奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S511

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