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《中国农业科学院》 2017年
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自组装IBDV病毒样颗粒的研制及应用

王淼  
【摘要】:鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)通过感染法氏囊组织中未成熟的B淋巴细胞,引起雏鸡急性死亡;耐过鸡呈现免疫抑制,免疫接种失败,对其它疾病易感性增加,给全球的养禽业带来了巨大的经济损失。目前,对IBD最有效的控制手段是接种疫苗。然而活疫苗具有毒力返强和与野毒重组的潜在危险,特别是中等毒力疫苗会造成对中枢免疫器官的直接损伤。相比全病毒疫苗,病毒样颗粒疫苗不含有病毒核酸,具有安全高效等诸多优点,是未来疫苗发展的重要方向。在本项研究中,我们通过酵母表达系统表达IBDV-VP2获得了两种重组的IBDV病毒样颗粒(T=1亚病毒样颗粒,sVP;T=13病毒样颗粒,VLP)。通过条件优化,实现了无需纯化即可稳定获得可以自我组装的IBDV-sVP的突破。工厂生产级别的发酵罐发酵培养,目的蛋白也能获得高水平表达,表达量可达到21 g/L,且可以组装成IBDV-sVP。通过动物免疫实验,对两种病毒样颗粒的免疫原性进行了评估和比较。结果显示,IBDV-sVP的免疫原性优于IBDV-VLP。攻毒保护实验显示,IBDV-sVP可以诱导高水平的IBDV特异性的中和抗体,使用IBDV超强毒(vvIBDV)攻毒后,经免疫鸡只100%存活,法氏囊组织无损伤并且无IBDV存留,实现了清除性免疫。同时,我们探索了表达IBDV-sVP酵母菌的口服免疫的保护效果。IBDV-sVP口服免疫的鸡在vvIBDV攻击后,死亡保护率可达90%,法氏囊组织损伤保护率可达70%,存活鸡的法氏囊组织中无IBDV残留。这说明,本研究研制的IBDV-sVP具有较高的疫苗应用价值。病毒样颗粒是鉴定病毒细胞受体的有效工具。IBDV的细胞受体尚未被确定。本研究利用上述IBDV病毒样颗粒开展了vvIBDV细胞受体的鉴定工作。通过IBDV-sVP和B淋巴细胞系DT40膜蛋白的病毒样铺覆实验(VOPBA)结合质谱分析,筛选了一系列疑似IBDV-Gx互作蛋白。经KEGG和Ami GO 2在线数据库分析,筛选出候选蛋白30个。通过siRNA结合流式细胞术试验,有进一步确定了8种潜在的IBDV受体分子。鉴于表皮生长因子受体(EGFR)在细胞内吞过程中发挥重要功能,我们最终选择EGFR蛋白进行了系统的鉴定。免疫沉淀实验表明IBDV-Gx与EGFR存在相互作用。过表达实验显示,DT40细胞膜表面EGFR过表达可以促进IBDV-Gx的复制,其病毒滴度提高了16倍。一系列的抑制实验结果表明,EGFR下调表达、抗EGFR蛋白抗体以及可溶性EGFR蛋白均可以显著抑制IBDV-Gx的复制,并呈现出剂量依赖性。病毒入侵实验表明,DT40细胞表面EGFR蛋白被抗体封闭后,IBDV侵入DT40细胞受到完全抑制。综上所述,我们确定EGFR蛋白是vvIBDV-Gx在DT40细胞的细胞受体组分。本研究建立了基于酵母发酵系统的高效而稳定的IBDV病毒样颗粒(IBDV-sVP)的制备工艺,且适合工厂化生产。所制备的IBDV-sVP具有良好的免疫活性,能100%抵抗vvIBDV的攻击,口服免疫的致死性攻毒保护率也高达90%。利用IBDV-sVP,也鉴定了一个新的IBDV细胞受体组分EGFR。本研究对IBDV的预防研究意义重大。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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