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《中国农业科学院》 2017年
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弓形虫钙依赖性蛋白激酶的功能及免疫保护性研究

王金磊  
【摘要】:弓形虫可感染包括人在内的几乎所有的恒温动物,全球大约有三分之一的人口受感染。健康人感染了弓形虫大多呈隐性感染,而对免疫功能低下的病人或者孕妇而言,可引起严重的并发症甚至死亡。孕妇或孕畜感染弓形虫时可能引起流产、畸胎甚至死胎。目前尚未有特效药物或疫苗能够防控弓形虫病。钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)广泛的存在于植物、绿藻和顶复门原虫中,且不存在哺乳动物中。在弓形虫中,目前发现的CDPK家族成员有14个,目前仅对CDPK1、CDPK3及CDPK7的功能有一定了解,其它家族成员的功能尚未报道。上述3个CDPKs在钙离子的调控下,主要参与入侵、胞内增值、逸出、运动和蛋白分泌等重要生物功能的调节。由于其不存在于哺乳动物中,CDPKs成为炙手可热的治疗弓形虫病的潜在药物靶标分子。因此,对弓形虫CDPKs家族的研究能够加深我们对弓形虫生物特征的了解,进而探讨其致病机制,为弓形虫病的防控夯实理论基础。在植物中,CDPKs存在时空表达差异性,并通过此调节各种应激反应。为探明弓形虫CDPKs家族是否具有类似的作用,我们参照现有的转录组数据对CDPKs家族成员在弓形虫不同状态(速殖子、缓殖子、卵囊)、入侵的不同时期以及不同细胞周期中表达情况进行分析。结果表明,CDPKs成员在上述不同时期存在表达差异情况。进而,我们利用荧光定量PCR分析酸性、碱性、高温及低温等条件对弓形虫CDPKs表达的影响,发现弓形虫CDPKs的表达受到上述不同的条件的影响,因此推断弓形虫CDPKs也像植物中的CDPKs分子一样参与应激反应。为了探究CDPKs家族中具体成员的生物学功能,利用高效的CRISPR-Cas9技术,分别在RH虫株中对CDPK4、CDPK4A、CDPK5、CDPK6、CDPK8及CDPK9进行敲除,构建了相应的缺失株。通过对这6个缺失株在宿主细胞入侵、逸出、胞内增殖等基本生物功能的分析,发现缺失这些基因不能明显影响上述几种生物功能;小鼠毒力实验发现这些基因对弓形虫的毒力的影响也不显著。为了进一步探究CDPKs家族中其他基因是否对这6个基因具有代偿作用,利用CRISPR-Cas9技术构建了8个CDPKs双缺失株(ΔCDPK4AΔCDPK4、ΔCDPK4AΔCDPK5、ΔCDPK4AΔCDPK6、ΔCDPK4AΔCDPK9、ΔCDPK8ΔCDPK4、ΔCDPK8ΔCDPK5、ΔCDPK8ΔCDPK6、ΔCDPK8ΔCDPK9),深入探究它们在弓形虫宿主细胞入侵、逸出、胞内增殖过程中的作用,以及通过小鼠毒力实验研究这些基因对弓形虫毒力的影响。结果表明,这些CDPKs家族成员在弓形虫的入侵、逸出、胞内增殖和小鼠体内增殖过程中不存着功能冗余现象,也不影响相关的生物性状,其具体生物学功能有待进一步探究。为了探究弓形虫CDPK2是否具有免疫保护性,以pVAX I作为真核表达载体构建了CDPK2基因的DNA疫苗。以肌肉注射的接种途径,连续免疫三次,每次间隔2周的免疫程序,接种BABL/c小鼠,同时监测与体液免疫和细胞免疫相关的指标的变化情况。于第三次免疫后14天,用弓形虫RH虫株进行攻虫实验,检测免疫保护情况。结果显示,CDPK2核酸疫苗可诱导BABL/c小鼠产生Th1型为主的体液和细胞免疫应答反应,并可以显著地延长小鼠的存活时间。说明CDPK2能诱导小鼠产生良好的免疫应答,对BABL/c小鼠具有较好的免疫保护性。最后,为了研究CDPK2在慢性感染中的作用,在II型PRU虫株中对CDPK2基因敲除,构建了PRUΔCDPK2虫株,抵抗弓形虫研究发现该缺失株丧失了形成包囊的能力,不能对小鼠形成慢性感染,进而我们探究了该缺失株作为弱毒疫苗的可能性。以PRUΔCDPK2缺失株腹腔接种昆明小鼠,并监测相应的体液免疫和细胞免疫指标变化情况,于免疫后70天进行攻虫实验,对免疫的小鼠通过腹腔注射的方式,分别感染RH、PYS及TgC7三种不同虫株的速殖子10~3个或通过口服的方式感染PRU包囊20个,监测小鼠的存活时间和包囊减少率。结果表明,经PRUΔCDPK2缺失株免疫的小鼠能够抵御RH、PYS及TgC7三种虫株的感染,起到免疫保护作用,同时对PRU包囊进行感染,能够显著减少小鼠脑中包囊数量,起到部分保护作用。为了探究PRUΔCDPK2缺失株对怀孕期间感染弓形虫的小鼠的免疫保护作用,分别在雌鼠怀孕第12天和19天,口服感染PRU虫株包囊10个或者腹腔注射RH虫株速殖子200个。结果显示经PRUΔCDPK2缺失株免疫的雌鼠能够明显地提高胎儿的存活率及胎儿的体重,同时减少胎儿脑中包囊数量。因此,PRUΔCDPK2缺失株有望成为防控弓形虫病的弱毒疫苗。综上所述,本试验首次分析了弓形虫CDPKs家族的基因表达谱;揭示了CDPK4、CDPK4A、CDPK5、CDPK6、CDPK8及CDPK9在弓形虫速殖子中的具体生物学功能评价了弓形虫PVAX-CDPK2核酸疫苗和PRUΔCDPK2弱毒疫苗的免疫保护力。这些研究结果不仅为进一步深入研究弓形虫CDPKs的其它生物学功能奠定了基础,也为研发弓形虫弱毒疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.7

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