收藏本站
《中国人民解放军军事医学科学院》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

潜在黏膜递送系统—重组乳酸菌的构建

曹晓梅  
【摘要】:多数病原微生物进入机体是通过黏膜表面,针对该类病原体发展黏膜免疫疫苗或治疗药物,对于预防或治疗疾病非常理想。乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一类食品级安全GRAS (Generally Recognized As Safe)微生物,也是人体肠道中的益生菌,对人类健康和营养有益处。 乳酸杆菌是健康妇女阴道内的正常菌群,能自洁阴道微生态环境,制约其它致病菌定植生长,也是阴道内的益生菌。以乳酸菌为黏膜免疫或治疗药物的递送载体,使抗原或治疗药物直接作用于黏膜表面,是疫苗或某些蛋白类药物的发展趋势。 本研究构建乳杆菌与乳球菌表达系统,拟用于阴道黏膜的重组微生态制剂或消化道黏膜的疫苗递送载体。 1、构建表达干扰素ω的重组乳杆菌。 构建以乳链菌肽Nisin为诱导物的NICE植物乳杆菌诱导表达系统(nisin-controlled expression, NICE)。Nisin是34个氨基酸的抗菌肽,其合成受到nisK(蛋白激酶)和nisR(调节蛋白)的双组分调节控制。本研究从乳球菌Lactococcus lactis 1.2030基因组DNA中克隆到nisA启动子,nisR、nisK基因,构建了带大肠杆菌复制子Ori和植物乳杆菌复制子p256、红霉素抗性标记的穿梭质粒pNIS300。将干扰素ω基因置于PnisA启动子下游,构建了pNIS300-ω表达质粒。经诱导表达后,发现蛋白在植物乳杆菌中的表达量微弱。随即采用类似于NICE系统的另一抗菌肽诱导表达系统,即以细菌素SapIP为诱导物,sapK和sapR为调节基因的表达质粒pSIP300。将干扰素ω基因置于PsapA启动子下游,组成干扰素表达质粒pSIP300-ω,在大肠杆菌DH5α中进行扩增,提取质粒后,分别电转化植物乳杆菌:Lacbacillus plantarum 1.3, Lacbacillus plantarum 1.11, Lacbacillus plantarum 14917。用Bender MedsystemsTM human IFN-ωELISA BMS233TEN试剂盒检测,重组菌Lacbacillus plantarum 1.11/pSIP300-ω能够表达IFN-ω。 2、构建拟用于口服或经鼻黏膜免疫的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis。 采用酸诱导P170启动子,在乳球菌生长过程中,受到自身代谢产生的H+和生长量的影响,培养基pH值不断下降,当pH在5.0-6.5之间时,启动子具有活性,这个过程正是菌体从指数生长期过渡到平台期时,既不需要额外添加诱导物,又可将菌体生长期与外源蛋白的生产期分开。采用SP310mmut2信号肽,该信号肽来源于乳酸乳球菌本身,并在酶切割位点后加上4个氨基酸AERS,这4个氨基酸有利于外源蛋白的分泌。将去除信号肽的鼠疫杆菌LcrV抗原结构基因置于AERS 4个氨基酸后,构成重组质粒pAMJ397-V,电转化感受态乳酸乳球菌Lactococcus lactis PSM565。经重组子PCR鉴定,菌体培养,SDS-PAGE检测,Western-blot鉴定,在Lactococcus lactis PSM565/pAMJ397-V培养基上清中获得了38kD的鼠疫抗原LcrV蛋白。用DEAE阴离子柱,对该蛋白进行了初步纯化。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士后
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 张晶,刘敬忠,谭淑珍,贾兴元,周艳;苯丙氨酸脱氨酶在乳酸乳球菌NICE系统的高效表达及其实验动物研究[J];生物工程学报;2002年06期
2 徐义刚;崔丽春;葛俊伟;赵丽丽;李一经;;表达重组猪瘟病毒E290多肽的干酪乳杆菌口服免疫特性及诱导特异性CTL反应的研究[J];生物工程学报;2007年05期
3 王红梅,李大金,姜红,袁正宏;hCGβ在乳酸杆菌中的分泌性表达[J];生殖与避孕;2003年03期
4 庾庆华;杨倩;;乳酸杆菌作为一种新型活疫苗抗原递送载体[J];世界华人消化杂志;2005年18期
5 陈辉,贾润清,康白,袁杰利,高绪文,齐春梅,张智清;人干扰素α-2b基因在德氏乳杆菌的表达与鉴定[J];中国微生态学杂志;2004年03期
6 贾兴元;陈星;苏畅;吕月平;高斌;肖白;刘敬忠;;人工合成苯丙氨酸脱氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达[J];中华微生物学和免疫学杂志;2006年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈丽园;石金舟;李闫;张明;张志红;;1株抗鸡白痢沙门氏菌的乳酸菌鉴定[J];安徽农业科学;2005年11期
2 张浩;莫海珍;;葡萄酒苹果酸-乳酸发酵细菌生理特性研究进展[J];安徽农业科学;2006年17期
3 李公美;夏娌君;单晓枫;张洪波;钱爱东;;酸奶中嗜热乳酸链球菌的分离鉴定及益生特性研究[J];安徽农业科学;2008年07期
4 许禔森;;德氏乳杆菌对鸡肠道菌群的影响[J];安徽农业科学;2008年08期
5 戚薇;石景;尹娅凤;王海宽;;植物乳杆菌IMAU10116产生抗娄地青霉活性物质培养基的优化[J];安徽农业科学;2011年19期
6 杨四润;马燕;杨明容;傅静;周红杰;;鲜牛奶中植物乳杆菌D14的分离鉴定[J];安徽农业科学;2011年23期
7 蒋成砚;谢昆;薛春丽;马迪;;乳饼中乳酸杆菌的分离·鉴定和产酸量研究[J];安徽农业科学;2011年34期
8 田洪磊;詹萍;;乳杆菌TZ-5对高脂饮食大鼠血脂水平的干预作用研究[J];安徽农业科学;2012年12期
9 祝嫦巍,王昌禄,顾晓波,郭键锋,唐如星;新型乳杆菌素产生菌的筛选及菌株特性的研究[J];氨基酸和生物资源;2002年01期
10 贺月林;郭照辉;谭周进;尹红梅;;酵母菌与乳酸菌混合培养中试研究[J];现代农业科技;2010年02期
中国重要会议论文全文数据库 前7条
1 胡静涛;杨文涛;肖冲;王泽;丁壮;王春凤;;GFP标记的重组新城疫病毒HN基因乳酸菌表达载体的构建[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 刘爱萍;蒋菁莉;任发政;刘松玲;;发酵乳中益生菌选择性计数培养基的研究[A];中国奶业协会年会论文集2008(下册)[C];2008年
3 郭迪;潘力;杨汝德;;耐盐乳酸菌的筛选和鉴定[A];第三届“益生菌、益生元与健康研讨会”论文集[C];2004年
4 聂炎炎;杨汝德;廖晓寰;文钰;;西藏“雪莲”共生菌的分离与特性研究[A];第三届“益生菌、益生元与健康研讨会”论文集[C];2004年
5 杨汝德;陈琼;陈惠音;;鸡源双歧杆菌的分离筛选和特性研究[A];第三届“益生菌、益生元与健康研讨会”论文集[C];2004年
6 欧阳清波;潘伟好;李平兰;贾玉春;;淡水鱼虾及猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其药敏性检测[A];北京食品学会2004年论文集[C];2004年
7 峥嵘;邰丽华;刘秀辉;斯日古楞;;RAPD技术对于3种乳酸菌遗传距离的分析[A];北方遗传资源的保护与利用研讨会论文汇编[C];2010年
中国博士188bet全文数据库 前10条
1 王春阳;秀丽隐杆线虫益生菌动物模型的建立及应用研究[D];山东农业大学;2009年
2 肖仔君;Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化潜手性酮不对称还原反应的研究[D];华南理工大学;2010年
3 轩辕铮铮;乳链菌肽耐受性调控新基因功能的研究[D];南开大学;2010年
4 李青青;耐氧性双歧杆菌的筛选及其生理特性与应用研究[D];浙江大学;2010年
5 赵建新;传统豆酱发酵过程分析与控制发酵的研究[D];江南大学;2011年
6 梁荣蓉;生鲜鸡肉调理制品菌群结构分析和货架期预测模型的研究[D];山东农业大学;2010年
7 刘海燕;转nisI基因植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 590对SD大鼠肠道健康的影响研究[D];江南大学;2011年
8 张丽;传统发酵牦牛奶中益生乳杆菌筛选及其免疫调节功能研究[D];甘肃农业大学;2011年
9 郭春锋;人源性益生菌降胆固醇机制及影响因素研究[D];哈尔滨工业大学;2011年
10 张春晖;中国优良酒类酒球菌(Oenococcus oeni)的分离筛选及苹果酸—乳酸发酵研究[D];西北农林科技大学;2001年
中国硕士188bet全文数据库 前10条
1 莫耽;机械损伤对锦橙汁品质的影响[D];华中农业大学;2010年
2 陈帅印;幽门螺杆菌ureB基因在乳球菌中食品级表达及免疫反应性[D];郑州大学;2010年
3 金龙;发酵鸡肉用乳酸菌的筛选及其发酵特性研究[D];安徽农业大学;2010年
4 郭艳萍;抑黄曲霉乳酸菌的筛选及菌种鉴定[D];安徽农业大学;2010年
5 李晓鹏;甘南牧区优良乳酸菌的分离筛选及开发应用[D];甘肃农业大学;2010年
6 崔琴;甘南牧区发酵牦牛酸乳中优良乳酸菌的筛选及发酵性能的研究[D];甘肃农业大学;2010年
7 彭城宇;罗非鱼片冰温气调保鲜工艺及其货架期预测模型研究[D];中国海洋大学;2010年
8 李凤娟;费氏丙酸杆菌费氏亚种亚油酸异构酶的研究[D];河南工业大学;2010年
9 万谦;乳酸菌质粒提取方法及电转化条件的研究[D];河南工业大学;2010年
10 赵立彬;优势菌种筛选与接种发酵提升泡菜营养品质及益生性的研究[D];石河子大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吕宏亮,李武平,张成海,马超,王玉淋,邹勇,衣作安,陈勇,吴斌文,段招军,侯云德;脑啡肽-干扰素α-m融合蛋白外用治疗单纯疱疹病毒感染[J];病毒学报;2002年02期
2 刘敬忠,向华,胡维,朱章菱,祝瑾,李氢元;苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达[J];生物工程学报;1998年04期
3 丁新华,岑沛霖,吴绵斌;粘红酵母产L-苯丙氨酸解氨酶的条件和酶法合成苯丙氨酸的研究[J];微生物学报;1994年02期
4 卫文仲,向华,谭华荣;人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达[J];微生物学报;2003年03期
5 向华,刘敬忠,胡维,祝锦,朱章菱;欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA在乳酸乳球菌中的表达研究[J];微生物学报;1999年03期
6 康白,袁杰利;阴道乳杆菌活菌制剂研究论文系列报导摘要[J];中国微生态学杂志;2001年04期
7 康白,李芳,袁杰利,蒋寒青,吕虎,文姝,傅晓丽,贺向荣,孙文萍;对德氏乳杆菌DM8909菌株的微生物学研究[J];中国微生态学杂志;2001年04期
8 康白,吕虎,傅晓丽,蒋寒青,文姝,袁杰利;对DM8909菌株治疗菌群失调性阴道病作用机制的研究[J];中国微生态学杂志;2001年04期
9 贾兴元,刘敬忠,向华,胡维,周艳,张鹏;高苯丙氨酸血症大鼠基因疗法的实验研究[J];中华医学杂志;2000年06期
10 梁雪芽,宋厚辉,江玲丽,陈雪燕,方维焕,李建荣;沙门氏菌的基因工程减毒以及在DNA疫苗载体中的应用[J];中国兽医杂志;2002年07期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张秀明,张文生,李慧,乔明强,高才昌;培养条件对乳酸乳球菌N302合成乳酸链球菌素的影响[J];南开大学学报(自然科学版);2005年03期
2 孔健,庄绪亮,马桂荣;固定化乳酸乳球菌连续生产Nisin的研究[J];微生物学报;2001年06期
3 陈星;高斌;贾兴元;苏畅;吕月平;王战勇;范新萍;肖白;刘敬忠;;使用偏爱密码子大幅度提高苯丙氨酸脱氨酶在食品级乳酸乳球菌中的表达[J];生物工程学报;2006年02期
4 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国;;乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达[J];中国人兽共患病学报;2008年03期
5 孙芝兰;孔文涛;孔健;;Paenibacillus sp.K1乳糖酶基因bga在乳酸乳球菌中的表达[J];山东大学学报(理学版);2008年07期
6 孙磊,孔文涛,孔健;乳酸乳球菌电转化条件的研究[J];山东大学学报(理学版);2005年03期
7 陈星;王璞;姚滢秋;肖白;;从基因工程乳酸菌中高效提取苯丙氨酸解氨酶的方法研究[J];生物技术通报;2008年03期
8 白贵蓉,李少英,张爱荣,周雨霞,乌尼;贺兰山地和腾格里沙漠牧区山羊乳中乳酸球菌的分离及其生物学特性研究[J];内蒙古农业大学学报(自然科学版);2000年03期
9 谷贵章;宋达峰;顾青;;乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定[J];生物技术;2006年06期
10 柳国霞;范丽平;霍贵成;;乳酸乳球菌的质粒消除[J];东北农业大学学报;2009年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 许云华;张伟娟;林燕青;李厚达;朱国强;;表达鹅细小病毒VP3结构蛋白重组乳酸乳球菌的构建[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
2 张晶;刘敬忠;贾兴元;谭淑珍;周艳;;苯丙氨酸脱氨酶在乳酸乳球菌NICE系统的高效表达及其实验动物研究[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
3 王迎华;陈燕;高丹丹;曹郁生;;大肠杆菌galU基因在乳酸乳球菌中的克隆及对产胞外多糖的影响[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
4 付瑞燕;陈坚;李寅;;谷胱甘肽保护乳酸乳球菌SK11抵抗氧胁迫[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
5 刘景芳;卫文仲;向华;;霍乱毒素B亚基在乳酸乳球菌中分泌表达的研究[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
6 孔健;马桂荣;;乳酸乳球菌中限制和修饰酶基因LlaBⅢ的克隆及分析[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
7 张娟;傅瑞燕;陈坚;李寅;;谷胱甘肽在乳酸乳球菌酸胁迫中的保护作用[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
8 傅瑞燕;华兆哲;陈坚;李寅;;构建重组乳酸乳球菌改良宿主菌发酵产酸性质[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
9 张娟;傅瑞燕;李寅;陈坚;;谷胱甘肽在乳酸乳球菌酸胁迫和冷冻胁迫中的保护作用[A];中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2005年
10 梁小波;钟瑾;还连栋;;纳豆激酶基因在乳酸乳球菌中的诱导表达[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 董丹 刘昱辉 吴元华;基因工程生产降钙素研究方兴未艾[N];中国医药报;2007年
2 丹尼斯克(中国)有限公司 金苏;功能基因组学在乳品发酵菌种和益生菌中的应用[N];中国食品质量报;2009年
3 李泽相;提高青贮饲料营养品质[N];湖北科技报;2005年
4 钱平;复合型防腐保鲜剂的应用[N];中国食品质量报;2004年
5 香红星;走进微生物世界让这个“小精灵”为你增效[N];中国畜牧兽医报;2007年
6 中国农业大学 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会 张日俊博士;重视动物微生态系统的生物防治和营养作用及微生态制剂的科学使用[N];中国畜牧报;2004年
7 淑玲;常用生物活性水质改良剂[N];中国渔业报;2005年
8 俞欣 陈茂樑;SARS免疫荧光检测法建立[N];健康报;2006年
9 ;与艾滋病魔赛跑[N];吉林日报;2006年
10 还连栋 沈颜新;帮你认识乳链菌肽[N];中国化工报;2000年
中国博士188bet全文数据库 前10条
1 曹晓梅;潜在黏膜递送系统—重组乳酸菌的构建[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年
2 轩辕铮铮;乳链菌肽耐受性调控新基因功能的研究[D];南开大学;2010年
3 徐毅;乳酸菌高效膜蛋白表达系统的构建及其自溶性质的研究[D];山东大学;2012年
4 胡春霞;大肠杆菌K88菌毛蛋白亚基FaeG重组乳酸乳球菌的构建及其对ICR小鼠免疫保护的研究[D];浙江大学;2009年
5 庄重;人β-干扰素和大肠杆菌O157:H7表面抗原EspA在乳酸乳球菌食品级诱导表达体系中表达及相关免疫活性分析[D];山东大学;2007年
6 刘珊娜;抗李氏杆菌细菌素及李氏杆菌噬菌体内溶菌素CBD基因的克隆与表达[D];天津大学;2012年
7 吴长毅;血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对失血性休克大鼠肠道屏障的保护作用[D];中国医科大学;2006年
8 庞庆丰;乳酸菌重组血红素加氧酶-1对肠道的保护作用[D];南京医科大学;2008年
9 顾青;幽门螺杆菌抗原UreB的基因工程及免疫原性研究[D];浙江大学;2005年
10 徐波;Lactococcus lactis食品级诱导表达系统构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达[D];南昌大学;2006年
中国硕士188bet全文数据库 前10条
1 龚芳红;幽门螺杆菌热休克蛋白A在乳酸乳球菌中的表达及免疫反应性鉴定[D];重庆医科大学;2010年
2 余凤云;重组乳酸乳球菌表达纳豆激酶的研究[D];武汉工业学院;2011年
3 方圆子;猪链球菌噬菌体SMP裂解酶在乳酸乳球菌中的表达及活性研究[D];上海交通大学;2011年
4 郭红敏;用质粒pMG36e电转化保加利亚乳杆菌和乳酸乳球菌的研究[D];河北农业大学;2010年
5 张磊;大肠杆菌粘附素faeG基因在乳酸乳球菌表面表达的研究[D];浙江师范大学;2010年
6 侯宏晓;乳链菌肽前体基因克隆及在乳酸乳球菌中的表达研究[D];西南农业大学;2002年
7 李蓉;植物乳杆菌中胆盐水解酶基因乳酸乳球菌NZ9000表达系统的建立[D];黑龙江八一农垦大学;2012年
8 陈金龙;产肠炎沙门氏菌外膜蛋白基因工程乳球菌的构建及性能初步研究[D];山东农业大学;2010年
9 王成;以nisI为选择标记的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建[D];华南理工大学;2010年
10 张波;植物乳杆菌胆盐水解酶基因的克隆及其在乳酸乳球菌ML23中的表达[D];河北农业大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026